不同羽色鸽种MC1R 基因的扩增与序列分析

2021-04-21汤青萍穆春宇杨明军夏爱萍付胜勇常玲玲

中国畜牧杂志 2021年4期

张蕊，汤青萍，穆春宇，杨明军，夏爱萍，付胜勇，常玲玲，卜柱*

（1.江苏省家禽科学研究所，江苏扬州 225125；2.河南天成鸽业有限公司，河南舞钢 462513）

羽色是禽类重要的外貌特征，可用于品种纯度的评价以及个体的雌雄鉴别，也可用于标记品种特征，辅助保护禽类遗传资源并指导育种。禽类羽色是由多基因控制的性状，其遗传机制复杂，基因间存在显隐性、互作、上位等关系，至今已发现多个基因座与色素形成有关，包括多种酶、结构蛋白、转录因子等[1]，其中一个重要的基因座是扩展位点E（Extension），该基因座影响真黑素和褐黑素的相对分布，其对应的编码基因为黑素皮质素受体1（Melanocortin-1 Receptor，MC1R）基因[2]。MC1R 为7 跨膜结构G 蛋白耦联受体，在黑色素细胞中起着重要作用，可以调控真黑素（包括棕色素和黑色素）的生成。MC1R基因只有1 个外显子，其多态性会引起氨基酸组成改变，使MC1R 的构象和功能发生改变，继而影响相应的调控因子，导致色素沉积表现为偏黑、偏褐或者偏白，最终造成羽色的差异[3]。

太湖鸽（暂定名）原产地为江苏省中南部，中心产区为环太湖地区。太湖鸽体型中等，全身大面积为白色，头顶一点黑色（或棕色），尾羽黑色（或棕色）盖过肛门，黑（棕）白两色之间界限整齐，大部分为凤头，少量平头，部分个体存在多趾性状，其毛色、凤头外观奇特，具有典型的特征。目前对于鸡、鸭、鹌鹑等禽类的羽色及其对应的基因座已有广泛而深入的研究，而鸽子羽色遗传机制研究还处于起步阶段。本实验以太湖鸽为实验组，以乌鸽（全身黑羽）和白卡奴鸽（全身白羽）为对照组，对其MC1R基因进行PCR 扩增，检测不同羽色鸽种MC1R基因的差异，为太湖鸽遗传资源的保护和品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验所用太湖鸽、乌鸽和白卡奴鸽均来自江苏威特凯鸽业有限公司。如图1 所示，太湖鸽全身大部分白羽，仅头顶和尾部为黑羽或棕羽，乌鸽为全身黑羽，黑色深浅程度存在差异，白卡奴鸽为全身白羽，没有其他颜色羽毛，采集3 个品种鸽血样各10 个，肝素钠抗凝，使用DNA 提取试剂盒进行血液基因组DNA提取，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2 引物设计根据NCBI 上鸽MC1R基因（登录号：XM_013367785.2）的序列信息，使用Primer 3 软件（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）在线设计1 对引物，引物信息：F：5'-GTGCCCTGGAGCTGAG GT-3'，R：5'-CCATTATCGGTGTCCCACTG-3'，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

图1 乌鸽、白卡奴鸽和太湖鸽（黑、棕）

1.3 PCR 扩增 PCR 扩增总体系为25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR premix（天根生物有限公司），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，9.5 μL ddH2O，2 μL 模板DNA。PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃终延伸8 min；10℃保存。PCR 产物经由1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将相同鸽种的不同个体进行混样，送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。

1.4 序列分析利用在线BLAST 软件进行序列同源性分析，用DNAMAN 预测该基因的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF），利用EXPASY 网站相关软件分析蛋白质结构域、分子量、等电点、跨膜区域等；使用Jalview 软件进行相关氨基酸序列比对；使用MEGA 5.1 软件进行进化树构建；使用SignaIP 4.1 在线预测信号肽；使用HNN 在线预测其氨基酸二级结构；使用SWISS-MODEL 在线预测其蛋白3D 结构。

2 结果

2.1 鸽MC1R基因的PCR 扩增结果由于MC1R基因仅有1 个外显子，本研究设计1 对涵盖整个外显子的引物进行PCR 扩增，扩增片段长度为988 bp，分别以太湖鸽、白卡奴鸽和乌鸽血液基因组DNA 为模板，经PCR 扩增获得与预期大小一致的目的片段及少许杂带（图2），送生物公司经切胶回收后测序，得单一峰图结果。

图2 鸽MC1R 基因PCR 产物电泳结果

2.2 鸽MC1R基因同源性分析对测序结果进行分析，获得942 bp 鸽MC1R基因完整编码区（Coding Sequence,CDS），共编码313 个氨基酸，分子量为35 659.63，等电点为8.78。进行序列比对分析发现，该序列与鸡、珠鸡、日本鹌鹑等同源性均达到90% 以上。根据本实验获得的太湖鸽（Taihu Pigeon）、白卡奴鸽（Carnean Pigeon）和乌鸽（Wu Pigeon）序列，利用MEGA 软件使用Neighbour-joining 法将本实验所得序列与GenBank上发表的鸡（Gallus gallus）、日本鹌鹑（Coturnix japonica）、火鸡（Meleagris gallopavo）、珠鸡（Numida meleagris）、绿头鸭（Anas platyrhynchos）、天鹅（Cygnus cygnus）、人（Homo sapiens）、猪（Sus scrofa）、鼠（Mus musculus）、水牛（Bubalus bubalis）等物种的MC1R基因mRNA 序列进行聚类分析，结果显示本实验获得的3 个鸽种单独聚为一类，最后与绿头鸭、鸡、火鸡等其他鸟类汇聚为一支，而人、猪、鼠等哺乳动物最后汇聚为一支（图3），这些结果均表明所得序列确实是鸽的MC1R基因。

图3 基于MC1R 基因氨基酸序列的系统发生树

2.3 太湖鸽MC1R 蛋白质序列的结构分析利用生物信息学在线软件分析发现MC1R 蛋白存在7 个跨膜区域（图4）；该蛋白为非分泌蛋白，定位于细胞膜上的概率最高；预测其蛋白3D 结构见图5，进一步验证了该蛋白预测的跨膜结构。

图4 太湖鸽MC1R 蛋白的跨膜区域分析

2.4MC1R基因序列及氨基酸二级结构差异分析测序结果发现（图6），白卡奴鸽与乌鸽的MC1R基因编码区核酸序列基本一致，且黑羽和棕羽太湖鸽的MC1R基因序列没有差异，而太湖鸽与另外2 个鸽种分别于279 bp（A＞G）（图6-a）和520 bp（G＞A）处存在碱基差异（图6），其中A279G 为同义突变，G520A 造成了氨基酸（Ser174Gly）的改变。太湖鸽与另外2 个鸽种仅在第174 氨基酸处存在差异，鸽子MC1R基因与其他鸟类MC1R基因编码区的序列长度存在差异，于第227氨基酸处缺失1 个氨基酸，于第26～31 氨基酸处存在连续氨基酸差异（图7）。相较于乌鸽和白卡奴鸽，太湖鸽MC1R 蛋白的α螺旋结构多一个氨基酸，而延长链结构少一个氨基酸（图8）。可见，这3 种鸽MC1R基因序列的部分碱基差异，造成对应氨基酸的差异，从而导致了氨基酸序列二级结构的不同。

图5 太湖鸽MC1R 蛋白3D 结构模型

图6 MC1R 基因突变位点

3 讨论

禽类羽色的差异主要是由黑色素的种类和分布不同造成的，黑色素主要有真黑素（Eumelanin）和褐黑素（Pheomelanin），是酪氨酸的衍生物，而真黑素和褐黑素的比例变化则主要由MC1R 及其拮抗剂刺鼠蛋白调控[4]。一般情况下，内源性的α-促黑色素细胞激素（α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH）结合MC1R 可以增加真黑素的生成，刺鼠信号蛋白（Agouti Signaling Protein，ASIP）与MC1R 结合则会抑制真黑素的生成，增加褐黑素（包括红色素和黄色素）的产生[5]。MC1R 是G 蛋白耦联受体家族中最小的受体，不同物种间存在着氨基酸序列长度的差异，如鸭为284 个氨基酸[6]、鸡为314 个氨基酸[7]、鹌鹑为314 个氨基酸[8]、犬为317 个氨基酸[9]等。本实验扩增获得的3 种鸽子MC1R基因编码区均为942 bp，共编码313 个氨基酸，BLAST 比对结果显示该序列与鸟类MC1R基因同源性较高，经进化树分析发现该序列与鸟类MC1R基因聚为一类，经跨膜区域分析可知该蛋白存在7 个跨膜结构，符合7 跨膜G 蛋白耦联受体特征，以上结果均表明所得序列为鸽子MC1R基因。由于棕色和黑色均属于真黑素，因而本实验获得的棕色羽和黑色羽太湖鸽的MC1R基因编码区没有差异。

α-MSH 和促肾上腺皮质激素分别是MC1R 的2 个配体，两者与黑色素细胞膜上的MC1R 结合后，会改变G 蛋白耦联受体的结构，激活膜上的腺苷酸环化酶系统，催化三磷酸腺苷（ATP）生成环磷酸腺苷（cAMP），进一步激活酪氨酸激酶，活化细胞内的酪氨酸酶，催化酪氨酸生成多巴同时多巴还能进一步被酪氨酸酶氧化为多巴醌，促使黑色或棕色真黑素合成[10-12]。当黑色素细胞中酪氨酸酶含量或活性较高时，会生成真黑色素，反之则生成褐色素。而ASIP 作为内源性拮抗剂可以竞争性地与MC1R 结合，并阻止cAMP 的形成，抑制酪氨酸酶活性，进而抑制真黑素产生。若ASIP 表达低则真黑素与褐黑素比例升高，羽色产生黑化变异，若ASIP 表达高，则羽色产生白化变异[13]。MC1R基因上的突变不仅可以改变黑色素生成相关基因的表达，还可以改变MC1R上游相关基因的表达，继而形成羽色差异。本实验发现，太湖鸽与乌鸽及白卡奴鸽于G520A 造成了氨基酸（Ser174Gly）的改变，太湖鸽在该位点为GG 纯合型，而乌鸽和白卡奴鸽在该位点为AA 纯合型，此结果与任嘉[14]在黑、白色羽鸽子上检测的结果一致，太湖鸽MC1R基因在此位点上的突变可能造成了相关基因表达的变化，继而造成羽毛色素沉积的差异。MC1R基因编码区的突变所造成的羽色差异可能因物种不同而存在差异，Zhan 等[15]研究发现矛隼MC1R基因编码区的1 个单碱基突变造成了黑、白羽色差异，但其白化或黑化性状可能还有其他位点的参与；而Bourgeois 等[16]则发现马斯绣眼鸟MC1R基因上的突变未造成黑化差异。本实验中黑色羽和白色羽鸽子的MC1R基因编码区没有差异，推测可能造成这2 种羽色差异的并不是来源于MC1R基因编码区的突变，而是MC1R基因调控区或者其他基因上的突变造成[17]。

图7 各物种MC1R 氨基酸序列比对图

图8 太湖鸽、白卡奴鸽和乌鸽MC1R 氨基酸序列二级结构预测示意图

动物的羽毛色素沉积模式主要由色素生成细胞（生黑色素细胞）的差异性分布以及黑色素合成通路调控，Gluckman 等[18]通过对日本鹌鹑（腹部白色而背部为有色羽）胚胎不同部位的毛囊组织进行羽色相关基因的表达分析发现，ASIP 转录本只在日本鹌鹑白色腹部毛囊组织中高表达而背侧没有，对MC1R 起活化作用的促黑素细胞皮质素原则在所有毛囊组织中高表达，这些结果表明鹌鹑腹部白羽的表型可能由MC1R 被抑制造成，而背部有色羽的形成可能需要MC1R 激活真黑素生成。Zhang 等[19]对不同羽色日本鹌鹑的MC1R基因和ASIP基因表达量进行检测后发现，日本鹌鹑的黑羽性状可能是由MC1R基因表达的上调或者ASIP的下调造成的。本实验中太湖鸽头顶和尾羽黑色而其他部位羽毛白色可能与ASIP的差异性表达有关，但有待于下一步验证。