原花青素在防控分泌性腹泻中的研究进展

徐 静，王 幸，雷 蕾，帅 柯,2，杨汉博,2*

（1.成都思来生物科技有限公司，四川成都 610041；2.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130）

原花青素又称原花色素、缩合鞣质，是以黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二醇（儿茶素或表儿茶素）为构成单元，以C-C 键结合方式聚合而成的一类黄酮化合物，普遍存在于花生衣、葡萄籽、松树皮、高粱皮、龙血巴豆等植物中，已被证实具抗氧化、抗炎等功能[1-3]。近年来，原花青素的抗分泌性腹泻功能被逐渐发现和确认。分泌性腹泻是某些病原菌（如产肠毒素大肠杆菌、霍乱弧菌等）、病毒（如轮状病毒）、炎症过程、药物、遗传等因素引起肠液分泌增多为主要特征、伴有吸收障碍的腹泻[4]。饲料中禁止添加抗生素、限量添加锌等政策实施后，断奶仔猪腹泻率升高、耗料增重比升高等关联性问题逐渐凸显，特别是产肠毒素大肠杆菌导致的断奶仔猪腹泻问题严重影响养殖生产效率，养殖行业亟需可有效预控分泌性腹泻的物质来解决该问题。本文就原花青素的生物活性、分泌性腹泻和原花青素抗分泌性腹泻机制等方面做一综述，旨在为防控断奶仔猪分泌性腹泻提供理论依据。

1 原花青素的结构与生物活性

1.1 原花青素的结构 原花青素的基本构成单元为黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二醇（以儿茶素或表儿茶素为主），是典型的C6-C3-C6结构的黄酮化合物。儿茶素或表儿茶素通常以C4-C8或C4-C6键聚合。根据聚合度不同，原花青素可分为低聚原花青素（聚合度2～5）、聚合原花青素（聚合度＞5，但仍易溶于水）和高聚原花青素（聚合度很高，且难溶于水）[1,3]。不同植物来源的原花青素含量、聚合度差异较大。Yamakoshi 等[5]研究表明，葡萄籽中原花青素含量为2%～8%（以葡萄籽干重计），其中低聚原花青素可达25%。刘睿等[6]研究发现，高粱皮中原花青素含量为1%～4%，但基本上为高聚原花青素。

原花青素的性质主要取决于其聚合度的不同。原花青素含大量酚羟基，聚合度增大，收敛性能（与蛋白质结合生成不溶于水的鞣酸蛋白）增强。不同聚合度的原花青素被肠道吸收的难易程度不同，聚合度越大，越难被吸收[7]。Dens 等[2]研究表明，原花青素聚合度为2～3 易被吸收、4～6 少量被吸收、7 以上则基本不被吸收。

1.2 原花青素的主要生物活性

1.2.1 抗氧化活性 原花青素是国际公认的抗氧化性极强的天然抗氧化剂，抗氧化活性是维生素E 的50 倍，是维生素C 的20 倍，尤其是体内抗氧化活性，是其他抗氧化剂难以媲美的[8]。原花青素的作用机制是其在体内释放H+，竞争性地与自由基结合并反应，一方面，可保护脂质不被氧化，阻断自由基链式反应；另一方面，经反应后产生的半醌自由基再通过亲核加成反应生成具有儿茶酸及焦酚结构的聚合物，仍然具有很强的抗氧化活性[9-10]。

原花青素的抗氧化活性与浓度、聚合度、羟基位置、连接方式、空间构型、溶剂等等均有关系。其活性呈剂量-效应关系，当超出一定浓度范围，其浓度升高，活性反而降低[8]。活性一般随着聚合度增加而增加；C3位置的甲氧基化和糖基化会降低活性；C4-C8连接方式的活性大于C4-C6连接方式；以表儿茶素为单元的聚合后的活性大于以儿茶素为单元的聚合；在水相中活性增强，在油相中活性降低[11]。尹梦宇[12]选用ABTS、DPPH自由基清除法和邻苯三酚自氧化法对原花青素进行了体外抗氧化性能测定，确证了原花青素具有显著的体外抗氧化效果；选定人体内稳定且最具有代表性的8-羟基脱氧鸟苷DNA 作为检测对象，并与维生素C+维生素E 片剂对比，原花青素的抗氧化效果优于维生素C+维生素E 组。

1.2.2 其他生物活性研究 除了抗氧化外，国内外学者对原花青素的活性展开了大量研究，主要包括降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗癌、调节血糖、神经系统性疾病、抗腹泻等方面[13-17]。其中，原花青素在抗腹泻上应用成果最为突出。2012 年，美国食品和药品监督管理局（FDA）批准Fulyzaq（商品名为Crofelemer）用于治疗AIDS 患者的腹泻症状；Crofelemer 提取自大戟科龙血巴豆的红色乳胶，是一种平均分子量约为2 200 ku 的多种原花青素单体的随机聚合的产物[18]。Crofelemer 是FDA 批准的第二例植物药，也是第一例口服植物药，说明其安全性、有效性等方面均得到认可，对于中医药进入欧美市场和作为处方药进入西医体系均具有史无前例的意义。唐青松等[19]研究表明，饲粮中添加500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的缩合单宁能够提高断奶仔猪生长性能和缓解腹泻，腹泻率分别降低7.72%和60.97%。

2 分泌性腹泻的发生原因及其机制

2.1 分泌性腹泻发生原因 分泌性腹泻的发生原因主要分为感染性和非感染性两类，其中感染性因素包括细菌感染（如可产生肠毒素的产肠毒素大肠杆菌或霍乱弧菌等，具有侵袭性的志贺氏菌或沙门氏菌等）、轮状病毒感染、寄生虫感染（溶组织性阿米巴、隐孢子虫），非感染性因素包括药物副作用（艾滋病、癌症药物性作用）、自身免疫性疾病（溃疡性肠炎、克罗恩病）、先天性疾病（微绒毛包涵性疾病、家族性腹泻）。分泌性腹泻临床症状主要表现为一般不发热、稀水便、无明显的白细胞增多，但伴有脱水、机体消瘦等症状，脱水甚者易死亡[5,20]。

2.2 分泌性腹泻发生机制 分泌性腹泻发生机制与细胞内介质（cAMP、cGMP、Ca2+）浓度升高而引起的水和电解质分泌增多、吸收受抑制有关。

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、霍乱弧菌主要是通过升高细胞内cAMP 或cGMP 浓度引发分泌性腹泻。ETEC 生长过程中可产生热敏性肠毒和（或）耐热性肠毒素，而霍乱弧菌生长过程中可产生霍乱毒素。巧合的是，热敏性肠毒素与霍乱毒素在空间结构上具有高度相似性，均为大分子蛋白，由A、B 亚基组成，A 亚基为毒性基团，B 亚基为受体识别基团。首先，B 亚基与肠上皮细胞神经节苷脂GM1 受体识别并结合，经饱饮或其他作用进入细胞，并在内质网将A、B 亚基分离。然后，A 亚基具有ADP-核糖基化转移酶活性，催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化成核糖基化腺嘌呤二核苷酸（ADP-R），ADP-R 激活兴奋性G 蛋白（Gsα蛋白）。最后，腺苷酸环化酶被Gsα蛋白激活，并催化三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），cAMP 浓度大幅升高，引发蛋白激酶A（PKA）破坏囊性纤维化跨膜调节传导（CFTR）通道，使氯离子、水分大量外流进入肠腔，超过正常的吸收能力，即发生分泌性腹泻[21]。耐热性肠毒素与热敏性肠毒素、霍乱毒素有类似致泻途径，但不同的是，耐热性肠毒素与肠上皮细胞神经节苷脂GM1 受体结合后，激活的是肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶，促使细胞浆中三磷酸鸟苷（cGMP）水平上升，最终引发分泌性腹泻[22]。热敏性肠毒素、霍乱毒素和耐热性肠毒素引发的分泌性腹泻常伴随严重脱水，特别是热敏性肠毒素和霍乱毒素是至今发现的最剧烈的致泻毒素，动物发病后，若不及时救治，极容易出现脱水、机体消瘦，甚至死亡现象。

志贺氏菌、沙门氏菌主要是通过升高细胞内Ca2+浓度引发分泌性腹泻。志贺氏菌或沙门氏菌侵袭进入肠上皮细胞后，刺激免疫细胞分泌IL-6、IL-8 和肿瘤坏死因子，引起细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+浓度升高不仅会使钙激活氯离子通道大量分泌氯离子，还会抑制钠氢交换蛋白（NHE3），减少钠离子吸收，最终电解质大量丢失，水分外流，发生分泌性腹泻[23]。

轮状病毒也主要是通过升高细胞内Ca2+浓度引发分泌性腹泻。轮状病毒进入细胞后，其非结构蛋白4（NSP4）识别整合素α1β2，并在肠神经作用下使Ca2+浓度升高，Ca2+浓度升高除了使钙激活氯离子通道大量分泌氯离子和抑制NHE3 外，还会抑制钠-葡萄糖共同转运蛋白（SLC5A1），减少钠离子吸收，最终，电解质和水分大量丢失，发生分泌性腹泻[24]。

另外，受到各种因素的刺激，肠道内源性脑啡肽酶、炎症过程中产生的血管活性肽（VIP）和5-羟色胺（5-HT）、钙-钙调节蛋白、P-物质等，也会间接使cAMP、cGMP 或Ca2+的浓度升高，引发分泌性腹泻。例如，内源性脑啡肽（一种肠道内源性阿片肽，在小肠中有促吸收和抗分泌的作用）与肠道基膜δ受体结合，直接抑制腺苷酸环化酶的活性，但可被内源性的金属蛋白酶—脑啡肽酶快速降解为亮-脑啡肽和蛋-脑啡肽，降解物失去促吸收和抗分泌作用，发生分泌性腹泻[25]。

2.3 断奶仔猪腹泻与分泌性腹泻的关系 由于仔猪断奶后胃肠道、免疫功能尚未发育健全，加之换料、转群、应激等因素影响肠道完整性及其正常功能导致的腹泻，即非感染性腹泻[26]；更重要的是由于感染以ETEC 为代表病原而发生的腹泻，即感染性腹泻。ETEC 导致腹泻的流程大致分为2 个过程：第一步，ETEC 的菌毛（黏附素）可识别肠上皮细胞受体，并黏附到肠上皮细胞上；第二步，ETEC 生长过程中产生肠毒素，特别是热敏性肠毒素，会迅速引发分泌性腹泻。黏附素、内毒素和肠毒素被认为是ETEC 致泻三要素，黏附素本身并无毒性，主要是将菌毛与肠上皮细胞黏附，以便于增殖；内毒素在肠道发生损伤的情况下才能吸收入血，仅当超过肝脏的解毒能力时才诱发炎症；而肠毒素则是直接作用肠道上皮细胞致泻，且该作用剧烈[27-28]。所以，断奶仔猪的感染性腹泻主要是分泌性腹泻。

3 临床上抗分泌性腹泻药物现状

目前，人医或兽医上已使用的治疗分泌性腹泻药物有洛哌丁胺、奥太曲、吩噻嗪、氯丙嗪、格列本脲、口服补液盐（ORS）、消旋卡多曲等。其中，洛哌丁胺、ORS、消旋卡多曲应用最广。原花青素则是FDA 批准用于抗分泌腹泻的新药[17,25]。

洛哌丁胺主要通过抑制肠道运动、延长吸收时间来作用；奥太曲主要通过抑制促分泌素（如VIP 和5-HT）的释放对神经内分泌瘤发挥作用；吩噻嗪和氯丙嗪主要通过抑制钙-钙调节蛋白，从而抑制激素刺激的cAMP效应；格列本脲能作用于氯离子通道，减少分泌。这几类药物在分泌性腹泻的不同治疗方案中均有价值，但存在副作用大、毒性大的风险，在适应症、适应人群等方面上均有较大限制。

ORS 能有效补充机体损失的水和电解质治疗脱水，是临床上最重要的辅助治疗手段，可降低腹泻死亡率约70%，但它并不能减少体液的流失、大便量或不能缩短病程。消旋卡多曲是通过抑制脑啡肽酶活性来提高肠道脑啡肽活性，进而降低肠道隐窝细胞内cAMP、Ca2+在肠道黏膜的浓度，减少水、电解质的分泌，同时增加水、电解质的吸收，可减少体液的流失或缩短病程，与洛哌丁胺、奥太曲等药物相比，具有效果确切、安全性高的特点，但其原料生产成本很高。原花青素来源于植物，经提取、分离、富集而成，成本更低、安全性更高。

4 原花青素抗分泌性腹泻的机制

原花青素抗分泌性腹泻的机制研究主要集中在作为ADP-核糖基化抑制剂或氯离子通道抑制剂，阻断分泌性腹泻发生途径中某些环节。

4.1 ADP-核糖基化抑制作用 原花青素可抑制霍乱毒素或热敏肠毒素A 亚基的ADP-核糖基化转移酶活性，阻断NAD 转化成ADP-R，抑制后续引发的腹泻效应，即原花青素抑制了ADP-核糖基化作用。也就是说，A亚基相当于产肠毒素细菌引发分泌性腹泻的“启动器”，而原花青素可以在它刚启动之初就“失灵”。野田公俊等[29]采用胍丁胺分析法表明，聚合度2～6 的原花青素可不同强度地抑制霍乱毒素催化ADP-核糖基化胍丁胺的生成，其表征方法是测定[腺嘌呤-14C]ADP-核糖基化胍丁胺的放射活性，而儿茶素单体却没有该抑制作用，且苹果、大黄、葡萄籽等不同来源的原花青素均具有该作用；兔回肠结扎法试验进一步表明，50 μg 原花青素可完全抑制由1 μg 霍乱毒素引起结扎肠道（10 cm）的体液积累。

4.2 抑制氯离子通道作用 原花青素抗分泌作用机制涉及靶向和抑制2 种不同的肠氯化物通道，即作为cAMP刺激的氯离子通道的CFTR 通道和CaCC 的抑制剂[30]。氯离子通道可认为是引发水、电解质外流的最后关卡，而原花青素 “镇守最后一道门”。Tradtrantip 等[31]研究证实，Crofelemer 抑制了CFTR 通道，最大抑制率接近60%，IC50 为7 μmol/L，并在CFTR 的细胞外位点产生的电压依赖性阻滞作用使通道闭合状态稳定，且在4 h 后最大抑制率仍保持30%以上（逆转小于50%）；进一步研究发现Crofelemer 通过与电压无关的抑制机制强烈抑制CaCC TMEM16A，最大抑制率＞ 90%，IC50为6.5 μM；Crofelemer 对2 个结构无关的肠道Cl-通道的双重抑制作用可解释其肠道抗分泌活性。Poorvi[32]认为，Crofelemer 用于缓解HIV 感染者接受抗逆转录病毒疗法（ART）的非感染性腹泻症状，确认其机制正是通过阻断胃肠腔中的氯离子通道来抑制氯离子的分泌，且具有耐受性好和安全性好的优势。Crutchley 等[33]、Jessica 等[34]试验表明，Crofelemer 可有效减少旅行者腹泻、霍乱等感染性腹泻患者的水样便量，并显著缩短病程时间，口服耐受性好。也就是说，Crofelemer 可以同时应用于非感染性和感染导致的分泌性腹泻。需要说明的是，Crofelemer（SP-303）是聚合度为3～30、平均分子量2 200 ku 的原花青素。而Fisher 等[35]采用来源相同、未分离纯化、主要成分占SP-303 质量67%、平均分子量为3 000 ku 的SB-303 与SP-303 对比的结果显示，SB-303 也具有抗分泌腹泻的活性，虽然效果略弱于SP-303，但提取工艺和成本大幅减少，这为对纯度要求不太高的领域（如饲料）具有很高的开发价值。

5 展 望

动物不发病或少发病是提高养殖生产效率的重要途径之一，而断奶仔猪感染性腹泻防控工作一直是生猪养殖的痛点和难点。原花青素是通过抑制肠毒素或其他物质导致的分泌亢进的某个环节或多个环节来实现抗分泌性腹泻的。需要注意的是，单独使用原花青素可在一定程度上控制分泌性腹泻，但保证肠黏膜正常结构完整与功能也是抗分泌性腹泻的基础条件。因此，原花青素与肠黏膜保护物质的组合使用将会是未来抗分泌性腹泻的重要手段。