杨桃花粉离体萌发研究

朱杨帆，何 江，黄歆怡，莫干辉，黄雪梅，陈豪军，欧景莉，陈 燕，宁 琳，周俊岸，荣 涛

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，南宁，530001)

杨桃AverrhoacarambolaL.又名洋桃、三稳子、五敛子等，属酢浆草科(Oxalidaceae)杨桃属植物，原产于东南亚热带亚热带地区，主要分布在我国广东、广西、云南、福建、海南、台湾等地区，是一种久负盛名的岭南佳果[1-2]。我国杨桃栽培历史悠久，20世纪80年代以后，逐渐从马来西亚、新加坡等地引进大果甜杨桃[3]。杨桃新品种选育方面，主要是从实生苗和嫁接苗中选择优良单株，选育的杨桃新品种主要有台农1号[4]、台农4号[5]、大果甜杨桃3号[6]、大果甜杨桃4号[7]等,但远不能满足国内市场需求，杨桃新品种选育对产业发展具有重要意义。花粉活力测定是开展育种工作的基础，杨桃花粉活力测定方面的研究鲜见报道。测定花粉活力主要有TTC染色法、醋酸洋红染色法、I2—KI染色法、离体萌发法等。由于染色法测定花粉活力只能反映花粉内营养物质含量或代谢情况，且颜色判断存在主观因素导致误差较大；离体萌发法被认为是检测花粉活力较为可靠的方法[8]。有关研究表明，蔗糖[9]、硼酸[10]、钙离子[11]在花粉离体萌发中对萌发率和花粉管生长有明显促进作用。因此，我们研究了不同浓度蔗糖、硼酸、氯化钙条件对杨桃花粉萌发率和花粉管生长的影响，旨在为杨桃科学授粉和育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以广西亚热带作物研究所杨桃种质资源圃的杨桃品种“香蜜”“夏威夷”为试材。

1.2 方法

在早晨花未完全开放前用镊子及时采摘当日开放花朵，放入硫酸袋中迅速带回实验室，立即进行花粉培养。

以略微改动的BK培养基[11]为基础培养基，采用单因素试验筛选培养基各组分最佳浓度，蔗糖设5%、10%、15%、20%等4个浓度，硼酸设0.001%、0.01%、0.1%等3个浓度，氯化钙设0.001%、0.01%、0.1%等3个浓度；探讨不同因素对花粉萌发的影响时，待探讨因素设置不同浓度梯度，以浓度0为对照，其余因素均以BK培养基(含10%蔗糖、0.01%硼酸、0.01%氯化钙)为假设的最适宜浓度。

花粉培养采用液体培养法。在凹槽载玻片的凹面中间滴加培养液50 μL，用镊子取发育良好的6朵花的所有花药于培养液中，用镊子轻轻点压载玻片上的花药，使花粉充分散落于培养液中。将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿内，在30 ℃条件下保湿培养3 h。用光学显微镜观察，每个载玻片选取3个不重复的视野，每个视野花粉数不少于20粒，以花粉管长度大于花粉直径视为萌发。花粉萌发率(%)=视野内已萌发的花粉数/视野内花粉总数×100

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010软件整理数据，所有试验数据为3次重复的平均值±标准差表示，用PASW Statistics 18软件进行差异显著性分析，使用Image-Pro Plus 6.0 软件测量花粉管长度。

2 结果与分析

2.1 蔗糖浓度的影响

由表1可以看出，蔗糖是杨桃花粉萌发的一个重要因素，当培养基的蔗糖浓度为0时，“香蜜”“夏威夷”的花粉萌发率极低，分别为0.87%和0.92%。随着蔗糖浓度升高，花粉萌发率和花粉管长度均呈先升后降的趋势。当蔗糖浓度达到10%时，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌发率均达到峰值，分别为79.56%和79.77%，显著地高于其他浓度处理；同时花粉管长度也达到最大值，分别为295.07 μm和271.71 μm，也显著地高于其他浓度处理。当蔗糖浓度达15%时，两个品种的花粉萌发率和花粉管长度比10%蔗糖处理显著地降低，“香蜜”花粉萌发率降至9.18%，而“夏威夷”花粉萌发率降低幅度较小，为51.43%。当蔗糖浓度为20%时，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌发率和花粉管长度均降至对照水平，花粉的萌发率分别为0.27%和4.31%，花粉管长度分别为38.00 μm和42.54 μm。

表1 不同蔗糖浓度培养基对两个品种杨桃花粉萌发率和花粉管生长的影响

2.2 钙离子浓度的影响

由表2可知，钙离子浓度为0时，两个品种的花粉都能够萌发，萌发率达50%以上，花粉管长度也都达到280 μm以上。钙离子浓度为0.01%时，两个品种花粉萌发率都达到79%以上，显著高于对照，明显促进了花粉萌发；而钙离子浓度0.1%时，两个品种的花粉萌发率均显著低于对照，“香蜜”“夏威夷”萌发率分别降低至11.17%和53.96%，过高的钙离子浓度抑制花粉萌发，但对“夏威夷”花粉萌发的抑制作用较弱。

2.3 硼酸浓度的影响

从表3可知，硼酸对杨桃花粉萌发和花粉管生长的影响和钙相似。硼酸浓度为0时，两个品种的花粉都能够萌发，萌发率达64%以上，花粉管长度也都达到275 μm以上。当硼酸浓度为0.01%时，两个品种杨桃的萌发率均最高，分别为79.56%和79.77%，“香蜜”花粉萌发率显著高于对照，“夏威夷”花粉萌发率与对照无显著性差异。而硼酸浓度0.1%时，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌发率分别降低至2.84%和2.24%，显著的低于其他处理，花粉管长度也显著降低，分别降低至111.69 μm和110.17 μm。过高硼酸浓度对杨桃花粉的萌发率和花粉管生长起到较强烈的抑制作用。

表2 不同钙离子浓度培养基对两个品种杨桃花粉萌发率和花粉管生长的影响

表3 不同硼酸浓度培养基对两个品种杨桃花粉萌发率和花粉管生长的影响

3 结论与讨论

适宜浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长起到显著的促进作用。蔗糖不仅作为一种营养物质为花粉萌发和花粉管生长提供能量，同时作为渗透物质为花粉萌发提供所需的渗透压[12]。蔗糖浓度适宜，能够维持花粉和培养基之间的渗透压平衡。蔗糖浓度过高，会造成花粉原生质脱水，导致花粉质壁分离；蔗糖浓度过低，花粉吸水，易造成花粉壁破裂，这两种情况都会抑制花粉的萌发。因此，蔗糖浓度必须在适宜范围内才能促进花粉萌发。不同植物花粉萌发所需培养基的蔗糖浓度有差异，应该与品种遗传差异和花粉所需渗透压不同有关。有关研究表明，薄壳山核桃花粉萌发适宜的蔗糖浓度是20%～30%[13]；当蔗糖200 g/L时甘蔗花粉的萌发率达到最高值[14]；促进火龙果花粉萌发的蔗糖最佳浓度为25%[15]。本试验中，当蔗糖浓度为0时，可使杨桃花粉萌发，但萌发率极低，可能由于杨桃花粉本身蕴含的营养物质使花粉少量萌发。当蔗糖浓度为10%时，两个品种的花粉萌发率都达到最高，可能此时的蔗糖浓度最接近于杨桃花粉萌发所需的渗透压条件，故萌发率较高。当蔗糖浓度为15%时，两个品种花粉的萌发率比10%蔗糖处理显著降低；当蔗糖浓度为20%时，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌发率分别降低为0.27%和4.31%，在蔗糖浓度过高的条件下，“夏威夷”花粉萌发率比“香蜜”高，可能是“夏威夷”花粉在不利生长的渗透压条件下抗逆性更强，有关原理还需进一步研究。

钙离子在花粉管的极性生长中起重要作用，钙离子在花粉管的尖端聚集，向内流十分活跃，钙离子的动态平衡对花粉的萌发和花粉管生长有重要影响[16]。相关研究中，“保罗兰”睡莲的花粉在氯化钙20 mg/L时最适宜萌发[17]，氯化钙5 mg/L适宜竹叶兰花粉萌发[18]。本研究中，钙离子浓度为0时，杨桃花粉有较高的萌发率，花粉管生长较好，可能是杨桃花粉自身所含的钙离子就能满足花粉生长发育，对外源钙离子表现为非必需组分。钙离子浓度为0.01%时，两个品种的花粉萌发率均较高，显著高于对照。因此，一定浓度的外源钙离子能在一定程度上提高花粉萌发率。而钙离子浓度为0.1%时，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌发率降低，分别为11.17%和53.96%，均低于对照，过高浓度的钙离子对花粉萌发起抑制作用。此时，“夏威夷”花粉萌发率高于“香蜜”，可能是“夏威夷”花粉在不利生长的钙离子浓度条件下抗逆性更强。

硼酸是促进花粉萌发的另一重要组分，适宜的硼酸浓度可显著提高花粉萌发率。硼酸对花粉管膜中的果胶合成有重要作用，参与花粉管顶端细胞壁的形成。此外，硼可与蔗糖形成络合物，增加花粉糖含量，加强糖的代谢活动[19]。相关研究表明，日本海棠花粉萌发的适宜硼酸浓度为0.02%[20]，香水莲花花粉萌发最适硼酸浓度为0.001%[21]。本研究中，硼酸浓度为0时，杨桃花粉也有较高的萌发率，花粉管生长也较好，可能是花粉本身所含的成分能够满足花粉萌发，对外源硼也表现为非必需组分。低浓度的硼酸能小幅度促进花粉萌发率，但硼酸浓度为0.1%时，则会显著抑制花粉萌发和花粉管生长。因此，在栽培管理中应注意硼肥浓度，从成本角度考虑建议不用单施硼肥。

综合来看，杨桃花粉萌发最适宜的培养条件为10%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%氯化钙，萌发率79%以上，花粉管长度达270 μm以上。此外，蔗糖或钙浓度过高时，“夏威夷”花粉萌发的抗逆性比“香蜜”更强，这对今后其杂交育种父本品种筛选等方面的研究具有参考价值。