葡萄柚酵母菌分离鉴定及其对3株青霉属致病菌抑菌效果研究

朱绍志，王 芳，孔珊珊，李文清，马电通，李贤忠，邓 佳，3

(1 西南林业大学林学院，昆明，650224；2 西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，昆明，650224；3 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，昆明，650224)

葡萄柚(CitrusparadiseMacf.)，又称西柚，是芸香科柑桔属植物中的一种，世界柑桔四大类群之一[1-2]。葡萄柚营养价值高，味酸甜略带苦味,主要用以鲜食、果汁等，深受消费者喜爱[2]。目前，中国是全球葡萄柚(含柚类)栽培面积和生产大国[3]，国内市场以鲜果消费为主[4]。但葡萄柚鲜果采后由于各种霉腐菌，尤其是Penicilliumitalicum(意大利青霉，引发青霉病)、Penicilliumdigitatum(指状青霉，引发绿霉病)等青霉属病原菌的危害[5],腐烂严重。一些发展中国家缺乏相应的贮藏设备和防腐技术，损失高达50%[6]，给葡萄柚贮藏、销售带来巨大的困难。因此，应对葡萄柚采后病害，急需寻找安全、高效、廉价的防腐措施。

目前，对葡萄柚采后病害的防治方法主要有化学方法、物理方法和生物方法。化学杀菌剂是目前果蔬防腐使用最广泛的防治方法，但长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生抗药性，且药物残留也会对人体健康、环境及动植物等产生危害[7-9]。物理方法主要为低温冷藏，但成本高，不易大量商业化生产应用。生物防治已被证明是一种有效的果蔬采后病害防控新途径[10]。其中，酵母菌的来源极其广泛[11]，具有安全、高效、抗逆性强、遗传稳定、不产生抗生素等优势，在鲜果采后病害防治上具有巨大的开发潜能，有望成为一种补充传统化学杀菌剂和冷藏技术的新型防腐技术[12]。

目前已报道的具有生防效果的拮抗酵母菌有40余种，主要为假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毕赤酵母属(Pichia)等[13]。目前，国外对葡萄柚拮抗酵母菌的研究已有一些报道。如：Droby等[14]用含有68 mmol/L或者136 mmol/L氯化钙的季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)悬液(107CFU/mL)，可将葡萄柚绿霉病的发病率从27%降低到3%。Droby等[15]研究了嗜油性假丝酵母菌(Candidaoleophila)应用于葡萄柚、柑桔表面伤口或完整的果实表面，均可引起葡萄柚或者柑桔果实采后对主要病原菌(P.digitatum)的系统性抗性。目前，国内对葡萄柚拮抗酵母菌的研究还少有报道。Wang等[16]研究表明，羧甲基壳聚糖与罗伦隐球酵母菌(Cryptococcuslaurentii)联合处理，比单一处理更能有效地保持葡萄柚果实品质和控制采后腐烂。

在本研究中，笔者选取云南葡萄柚种植区栽培微环境，对葡萄柚果实、叶片和根际土壤进行酵母菌的分离、鉴定，并采用离体、活体试验方法筛选出对葡萄柚青霉属致病菌有较好抑菌效果的拮抗酵母菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌样本来源 在昆明市西南林业大学大棚种植基地和普文种植基地，分别采集健康葡萄柚的果实、叶片和根际土壤样品，用于酵母菌的分离。每个样品采集3份，用无菌自封袋分装，并于4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 病原菌来源 病原菌来源于发病腐烂葡萄柚和金柑。其中，Penicilliumdaejeonium、Penicilliumcrustosum来自发病葡萄柚果实，Penicilliumdigitatum来自发病金柑。经活体验证，3株病原菌均为葡萄柚致腐菌。

1.1.3 培养基 YM培养基(麦芽汁琼脂培养基)[17]：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母粉3 g，麦芽提取物3 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH值调至6.2。121 ℃灭菌30 min。

PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)[18]：土豆200 g，葡萄糖(蔗糖)20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH值不调整。121 ℃灭菌30 min。

1.1.4 葡萄柚果实 活体试验的果实购于佳沃(青岛)果业有限公司，品种为“里约红”葡萄柚。从中挑选无机械损伤、无病虫害、大小均匀、成熟度较一致的果实作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化 果实及叶片样品酵母菌株的分离：将健康葡萄柚的果皮或叶片(20 g)分别装于300 mL无菌烧杯中，加入PBS缓冲液150 mL，将其放在100 r·min-1摇床上，震荡30 min。在无菌操作台内取出果实和叶片，用无菌水进行梯度稀释，选取10-1、10-2两个梯度，分别各取200 μL涂布于YM培养基，每个样品重复3次。在28 ℃恒温培养3～5 d，观察菌株生长情况，挑取形态差异明显的单个菌落，利用平板划线法纯化后保存备用[8]。

根际土壤样品酵母菌株的分离：称取10 g土壤样品，放入装有玻璃珠的250 mL三角瓶中，再加入无菌水90 mL，在摇床上以200 r·min-1的速度振荡30 min，制成初始土壤悬浮液。在无菌操作环境下用无菌水进行梯度稀释，选取10-2、10-3、10-4三个梯度，分别各取200 μL涂布于YM培养基。每个梯度做3次重复，28 ℃培养3～5 d，观察菌株生长情况，挑取形态差异明显的单个菌落，利用平板划线法纯化后保存备用[8]。

1.2.2 酵母菌的鉴定 供试菌株菌落和显微形态特征：观察分离供试菌株在YM培养基上生长的菌落形态特征，并利用普通光学显微镜在40倍镜下观察分离菌株的显微形态，对分离菌株进行初步鉴定。

供试菌株ITS及LSU序列测定及同源性比对：供试菌株DNA的提取，参照生工Ezup柱式真菌基因组DNA提取试剂盒进行[19]，然后分别利用ITS及NL通用引物进行ITS及LSU序列扩增[20-22]。引物序列为ITS1: 5’-GTCGTAACAAGGTTAACCTGCGG-3’, ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。PCR扩增反应体系如下：2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，引物ITS1、ITS4各1.5 μL(或NL1、NL4各1.5 μL)，DNA 2 μL[12,23]。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[24]。PCR产物纯化后，送昆明擎科生物科技有限公司进行测序。测序所得序列在NCBI数据库中与已知序列进行BLAST比对分析，并利用MEGA 7.0 软件进行系统发育分析。

1.2.3 离体抑菌筛选 将分离筛选得到的3株葡萄柚病原菌，分别接种到PDA培养基上，25 ℃恒温培养5 d备用。另外，将酵母菌接种到YM培养基上，25 ℃恒温培养3～5 d，收集菌体，用血球计数板配制成107CFU/mL的酵母菌菌悬液。 采用平板对峙法[25]，通过离体抑菌对分离得到的酵母菌进行抑菌筛选，初步筛选出对病原菌有较好抑菌效果的拮抗酵母菌。具体方法为：在PDA培养基中间放置一个直径6 mm的病原菌菌饼，同时在距其边缘3 cm的4个正十字位置上均匀放置滤纸片，每点滤纸片上加入5 μL酵母菌菌悬液,对照组4个点为相同量的无菌水，每个处理3个重复；25 ℃恒温培养2 d后开始观察抑菌效果，定期记录病原菌直径，计算抑菌率。抑菌率=[(对照病原菌直径-处理病原菌直径)/对照病原菌直径]×100%[26]。

1.2.4 活体抑菌效果 选取健康、完好的成熟期葡萄柚果实，在无菌环境下先用无菌水将其表面灰尘等附着物冲洗干净，再用75%酒精擦拭果面，晾干。用灭菌竹签在葡萄柚果实赤道面均匀扎4个孔(5 mm ×5 mm)，每孔接种20 μL配置好的拮抗酵母菌菌悬液(107CFU/mL)，以无菌水为对照。室温放置2 h，等孔晾干后，接种等量的病原菌菌悬液(105CFU/mL)。后将葡萄柚果实用无菌自封袋单果包装，置于室温条件下，每隔12 h定期观察果实发病情况，记录果实病斑直径，计算果实的发病率及病斑抑制率。每8次重复处理为一个处理组(每个处理组2个果实)，重复3个处理组。果实病斑抑制率=[(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径]×100%；果实发病率=(发病接种数/总接种数)×100%。

1.3 数据处理

数据处理及图表制作采用Excel 2010软件，数据显著性分析采用SPSS Statistics 17.0进行Duncan’s多重差异显著性分析以及进行独立样本T检验，差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离鉴定

经菌落形态和显微形态观察，共得到5株酵母菌。其中，菌株YY(1)、YY(2)分离于西南林业大学大棚种植基地的葡萄柚叶片，菌株nf(1)、nf(2)、nf(3)分离于普文种植基地健康葡萄柚的果实。各菌株的形态特征见图1和表1。

表1 试验分离所得5株酵母菌的形态特征

图1 试验分离所得5株酵母菌的菌落形态和显微结构特征

在根据ITS和LSU序列分别构建的系统发育树(见图2)中，菌株YY(1)均与Pseudozyma聚在一起，属于Pseudozyma属，且与菌株PseudozymafusiformataAP6的序列相似性为100%；菌株YY(2)和nf(2)均与Meira聚在一起，ITS序列系统发育树中与菌株MeiranashicolaCBS117161的序列相似性最高，分别为99.5%和99.3%，LSU序列系统发育树中均为100%；菌株nf(1)与Moesziomyces均聚在一起，与菌株MoesziomycesantarcticusMAFF307206的序列相似性最高，分别为100%和99.8%；菌株nf(3)均与Kwoniella聚在一起，与菌株KwoniellamangrovensisCBS8507的序列相似性最高，分别为98.6%和99.8%。一般认为，供试菌株的rRNA序列的序列相似性在95%～99%属于相同的属，序列相似性99%～100%属于同一菌种[27-29]。由此判断，分离所得酵母菌株YY(1)为Pseudozymafusiformata，nf(1)为Moesziomycesantarcticus，nf(3)为Kwoniellamangroviensis，YY(2)和nf(2)属于同一个种Meiranashicola。

图2 试验分离所得5株酵母菌基于ITS序列(A)和LSU(B)序列构建的系统发育树

2.2 酵母菌对病原菌的离体抑菌效果

经离体抑菌试验发现，5株酵母菌对病原菌P.digitatum、P.crustosum和P.daejeonium均有一定的抑制效果。菌株YY(1)、nf(1)对3株病原菌的抑菌效果较好。菌株YY(1)对3株病原菌的抑菌率会随着时间的延长而逐渐增加，而菌株nf(1)对3株病原菌的抑菌效果随着时间的延长没有显著差别。在第8 d时，酵母菌株YY(1)对病原菌P.digitatum、P.daejeonium的抑菌率分别达到55.20%、59.00%，明显高于其他酵母菌株(见表2)。

2.3 酵母菌对病原菌的活体抑菌效果

选择离体抑菌效果好的菌株YY(1)和nf(1)进行活体抑菌试验。结果表明，YY(1)和nf(1)可以不同程度地降低3株青霉病原菌在果实上的发病率，抑制果实病斑直径增长。其中，YY(1)对病原菌P.digitatum和P.daejeonium的抑菌效果最好，nf(1)的抑菌效果次之；而YY(1)和nf(1)对病原菌P.crustosum的抑菌效果没有明显差别(见图3、表3和表4)。

表2 5株酵母菌对3株青霉病原菌的离体抑菌率比较 %

注：JJ-1: P. digitatum; YZ-2:P. crustosum; YZ-3: P.daejeonium。

表3 2株酵母菌YY(1)和nf(1)对3株青霉病原菌活体抑菌后的发病率 %

表4 2株酵母菌YY(1)和nf(1)对3株青霉病原菌在果实上病斑的抑制率 %

3 讨论与结论

葡萄柚采后在贮藏、运输、销售过程中，各种病原菌极易通过伤口侵入果实，引起果实腐烂[9]。青霉菌是导致柑桔类果实采后腐烂的主要病原菌，也是葡萄柚采后腐烂的主要病原菌。采后葡萄柚果实营养物质和含水量高，pH值低，适宜青霉菌的生长[30]。针对传统病害防治方法的缺点和不足，拮抗酵母菌具有高效、廉价、安全、环保等优点，逐渐成为采后病害防治的研究热点[31]。如：Wilson等[32]研究了两株酵母菌(Debaryomyceshansenii、Aureobasidiumpullulans)对柑桔采后青霉腐烂病的防治效果，结果表明，两株酵母菌对青霉病均有一定的抑菌效果。耿鹏[24]从水果样品上分离得到一株马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，通过离体和活体抑菌试验表明，不同浓度的酵母菌悬液对柑桔绿霉病均有一定的防治效果。类似的研究中，Droby等[33]从葡萄柚表面分离得到4株酵母菌：清酒假丝酵母、假丝酵母、嗜油性假丝酵母和汉森氏假丝酵母。其中，假丝酵母对指状青霉(P.digitatum)的抑菌效果最好。Liu等[23]对重庆北碚地区柑桔园柑桔果实、叶片和土壤表面进行酵母菌的分离、鉴定，通过离体抑菌试验表明，酵母菌Metschnikowiasp. FL02接种后第7 d完全抑制了P.digitatum的生长。

本研究对葡萄柚果实、叶片和根际土壤进行酵母菌的分离和鉴定，获得5株酵母菌：分离于西南林业大学大棚种植基地的葡萄柚叶片的YY(1)、YY(2)，以及分离于普文种植基地健康葡萄柚果实的nf(1)、nf(2)、nf(3)。通过形态学和ITS、LSU分子生物学鉴定，YY(1)为Pseudozymafusiformata，YY(2)和nf(2)为Meiranashicola，nf(1)为Moesziomycesantarcticus，nf(3)为Kwoniellamangroviensis。活体抑菌试验结果表明，拮抗酵母菌YY(1)和nf(1)对病原菌P.digitatum、P.daejeonium均有较好的抑菌效果，可以降低果实的发病率，抑制果实病斑的发展。其中，YY(1)的抑菌效果最好，值得进一步用于青霉致病菌的防控试验。