猪源枯草芽孢杆菌BL-Y9益生特性研究及小鼠安全试验

辛国芹， 汪祥燕， 宁慧宇， 徐海燕， 谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室，山东泰安271000）

益生菌是指定植于动物机体， 能够促进宿主微生态平衡、 促进营养吸收等有益于宿主的活性微生物。 其具有抑制病原菌、 促进营养物质消化吸收、绿色、安全无污染等优势，随着禁抗时代的到来， 益生菌被认为是饲用抗生素的最佳替代品之一（李雯静等，2013；董秋月等2012）。 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，具有耐高温、耐酸碱、抗逆性强、易贮存等优点，因具有改善消化道内环境、促生长、提高免疫力及分泌产生多种消化酶等功能而得到广泛应用 （何明清等，2004）， 早在1999 年就被农业部列为可直接添加到饲料中的绿色添加剂（陶荣霞，2012）。

枯草芽孢杆菌作为理想的微生态制剂， 对常见畜禽病原菌有良好的抑菌效果。研究证明，来源于动物肠道的益生菌可发挥更好的定植及肠道益生功效（周珍辉等，2017）。目前关于芽孢菌产酶抑菌性能的报道较多， 但关于对饲料消化性能的研究相对较少。 本研究对试验分离的猪源枯草芽孢杆菌，研究其抑菌、产酶性能，并利用模拟消化试验研究小鼠对不同饲料组合的消化作用， 进一步测定其饲喂安全性，为畜禽养殖提供可抑菌、促消化进而改善畜禽营养消化吸收且安全的芽孢菌，以期为优良菌株的筛选提供基础， 为枯草芽孢杆菌微生态制剂的研发提供菌种储备及应用依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用菌种 菌株：枯草芽孢杆菌BL-Y9由山东宝来利来生物研究院从新鲜猪粪中分离，经数次传代，活性稳定。

指示菌：猪大肠杆菌K88、鸡大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌CVCC533 均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 金黄色葡萄球菌C56011 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

1.1.2 试验动物 健康昆明种小白鼠，体重（20±2）g，购于山东鲁抗医药股份有限公司，合格证号：SCXK（鲁）2013-0001。

1.1.3 饲料原料 选择常见的饲料原料玉米、豆柏、麸皮、棉籽粕4 种，60 ℃烘干后粉碎，过40 目筛，按一定比例组合备用，如表1 所示。

表1 不同饲料组合原料配方 %

1.1.4 培养基及试剂 芽孢菌斜面培养基： 蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。芽孢菌液体种子培养基：葡萄糖2 g、 酵母膏5 g、 蛋白胨10 g、NaCl 5 g， 蒸馏水1000 mL，pH 7.0。 指示菌发酵培养基：同芽孢杆菌液体种子培养基。抑菌试验检测培养基：营养琼脂（NA）。

BCA 法测可溶性蛋白试剂A 的配制：2.5 g BCA 二钠盐，5 g 无水碳酸钠，0.4 g 酒石酸钠，1 g氢氧化钠，2.4 g 碳酸氢钠， 加250 mL 水溶解，用氢氧化钠调节pH 至11.25。BCA 法测可溶性蛋白试剂B 的配制：2 g 五水硫酸铜， 加50 mL 水溶解。BCA 工作液由100 mL 试剂A 和2 mL 试剂B混合，现配现用，可稳定一周。

本研究中所需其他试剂及溶液均按常规自行配制。

1.2 试验方法

1.2.1 指示菌发酵液的制备 将指示菌斜面接种到装有50 mL 液体培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 条件下恒温振荡培养18 h。

1.2.2 代谢产物的制备 将BL-Y9 接种在斜面培养基中，37 ℃培养复壮，24 h 后传代到装有30 mL液体种子培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 恒温振荡培养芽孢率80%以上，5000 r/min 离心10 min， 取上清液经细菌滤器过滤（滤膜直径为220 nm）， 收集滤液即为代谢产物，然后用打孔法对代谢产物进行抑菌活性测定。方法如下：用0.9%的灭菌生理盐水将病原菌原发酵液稀释至106cfu/mL， 吸取稀释好的病原菌使用液0.6 mL 加入平板中，无菌操作吸取15 mL 冷却至50 ℃左右灭菌的营养琼脂固体培养基，加入到上述已加病原菌的平板中，混匀，平板冷却后用2.7 mm 的直径打孔器打孔，每孔分别注入10 μL样品处理液。 正置2 h 后，再倒置放于37 ℃培养箱内，培养24 h。 每个样品做三个平行。

1.2.3 发酵液中性蛋白酶及纤维素酶酶活的测定 中性蛋白酶酶活的测定采用福林酚法，酶活力定义为：1 mL 酶液（1 g 酶粉）在40 ℃、pH 7.5的条件下， 每分钟内水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需的酶量为1 个蛋白酶活力单位， 以U/mL（U/g）表示。

纤维素酶酶活测定采用CMC 糖化力法，酶活定义为：1 mL 液体酶在40 ℃、pH 4.6 条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC）产生1.0 μg 的葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/mL 表示。

1.2.4 枯草芽孢杆菌BL-Y9 对不同组合饲料的消化对比试验

1.2.4.1 模拟消化试验 称取不同类型饲料组合10 g 于250 mL 的三角瓶中，121 ℃灭菌30 min加入50 mL 的无菌水， 用HCl 溶液调节pH 至3.0，加入备用的菌液1 mL，摇匀后静置30 min 后用NaOH 调节pH 至6.7，加入10%猪胆酸盐溶液至终浓度为0.05%，37 ℃、50 r/min 条件下培养72 h，60 ℃烘干后测定干物质、粗纤维、还原糖、可溶性蛋白等含量。

1.2.4.2 还原糖的测定 采用DNS 比色法，参考GB/T23881-2009。取0.5 mL 消化完成后过滤的滤液于25 mL 具塞刻度试管，加入蒸馏水和DNS 溶液各1.5 mL，沸水浴10 min，取出立刻冷却并定容至25 mL，540 nm 条件下比色。 根据OD540nm吸光度在标准曲线中查得还原糖浓度， 将单位换算成每克组合饲料中含还原糖的毫克数。

1.2.4.3 游离氨基酸的测定 采用福林酚法，参考GB/T23527-2009，取1 mL 滤液加入10 mL 离心管，加入2 mL 65.4 g/L 的三氯乙酸，4000 r/min离心5 min。取1 mL 上清加入5 mL 44.2 g/L 碳酸钠溶液，加入1 mL 福林酚试剂，40 ℃条件下水浴20 min，测OD680nm值。

1.2.4.4 可溶性蛋白含量的测定 采用BCA 二钠法，取适当稀释倍数的滤液50 μL 于10 mL 离心管，加入1 mL BCA 工作液，混匀后，56 ℃水浴30 min，测OD562nm值。

1.2.4.5 酸溶蛋白含量的测定 采用BCA 二钠法，取20 倍稀释的滤液1 mL 于10 mL 离心管，加入1 mL 15%TCA 溶液，静置30 min，4000 r/min 离心10 min， 取出50 μL 上清液加入1 mL BCA 工作液，混匀后，56 ℃水浴30 min，测OD562nm值。

1.2.4.6 粗纤维含量的测定 参照GB/T6434-2006 方法测定消化残渣干物质中粗纤维含量。

1.2.5 菌株BL-Y9 对小鼠的安全性试验 灌胃菌液的制备： 将待测菌株以2%接种量接种到液体培养基中，37 ℃、180 r/min 条件下培养24 h，将菌液转置无菌离心管中，4000 r/min 离心5 min，收集菌体， 分别加入无菌生理盐水及上清液混匀，调至活菌数浓度分别为1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/0.2 mL。

试验方法： 清洁级雄性昆明小鼠适应环境3 d后，进行随机分组，分为对照组、不同剂量组，每组10 只。 分组时做好标记，对照组使用生理盐水，不同剂量组分别灌胃不同活菌数的菌悬液， 每只0.2 mL，每天灌胃1 次。 试验中观察小鼠的各项指标，并做好记录。 饲喂一周后进行剖杀，计算小鼠体重变化， 解剖观察肝脏、 脾脏及肾脏有无病变。

2 结果与分析

2.1 菌株BL-Y9 发酵液抑菌及产酶性能

2.1.1 抑菌性能 由表2 可以看出，菌株BL-Y9对供试病原菌抑制效果较好， 对鸡大肠杆菌O78抑菌效果优于猪大肠杆菌K88， 对鸡白痢沙门氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直径达到13.33 mm。

表2 菌株BL-Y9 体外抑菌圈直径 mm

2.1.2 产酶性能 如表3 所示， 菌株BL-Y9 在37 ℃、180 r/min 条件下培养24 h 芽孢率约为95%左右，测得发酵上清液中性蛋白酶、纤维素酶酶活分别达到184.98、9.68 U/mL， 中性蛋白酶活性高于刘秀侠 （2019） 报道的最高酶活产生菌BLLL-2 发酵上清液约50 U/mL。

表3 菌株BL-Y9 粗酶液酶活 U/mL

2.2 菌株BL-Y9 对不同组合饲料的体外消化对比试验

2.2.1 干物质消化率 如图1 所示， 三种饲料组合经菌株BL-Y9 处理后干物质消化率差别较大，对玉米面+豆粕组合干物质消化率较高，为37.79%，玉米面+棉籽粕组合干物质消化率最低，为18.25%，比前者低19.54%。

图1 3 种组合饲料经枯草芽孢杆菌BL-Y9 处理后消化液干物质消化率

2.2.2 游离氨基酸含量 如图2 所示， 三种饲料组合经菌株BL-Y9 处理后游离氨基酸含量增加幅度差别不大，都在150%以上，且以玉米面+麸皮组合游离氨基酸含量增加幅度最大，为168.6%。

2.2.3 可溶性蛋白含量 如图3 所示， 三种饲料组合经菌株BL-Y9 作用72 h 后可溶性蛋白含量增加明显，与空白对照组相比，玉米面+豆粕组合可溶性蛋白增加幅度最高，为438.11%。

图2 3 种组合饲料经枯草芽孢杆菌BL-Y9 处理后消化液中游离氨基酸增加幅度

图3 3 种组合饲料经枯草芽孢杆菌BL-Y9 处理后消化液中可溶性蛋白增加幅度

2.2.4 还原糖含量 如图4 所示， 三种饲料组合经菌株BL-Y9 作用后与空白对照组相比还原糖含量增加明显， 以玉米面+麸皮组合还原糖含量增加幅度最高，为468.67%；其次为玉米面+豆粕组合，增加幅度为325.62%，玉米面+棉籽粕组合增加幅度最低，为233.16%。

图4 3 种组合饲料经枯草芽孢杆菌BL-Y9 处理后消化液中还原糖含量增加幅度

2.2.5 酸溶蛋白含量 如图5 所示， 三种饲料组合经菌株BL-Y9 作用后酸溶蛋白含量增加明显，以玉米面+麸皮组合含量增加幅度最高，为176.72%，其次为玉米面+棉籽粕组合，增加幅度为131.39%。

2.3 小鼠安全性试验 各组小鼠灌胃处理，正常饲养期间观察各组小鼠的体态、体征及毛色，试验结束后各组之间均无肉眼可见的差异， 饲喂一周后进行剖杀， 对各组小鼠的体重及脏器指数进行分析，结果如表4 所示。经口给予不同剂量受试物7 d 后，各组小鼠的体重无显著性差异。试验组小鼠体态正常， 肝脏、 脾脏和肾脏均无肉眼可见变化，脏器指数无显著差异，表明菌株BL-Y9 在灌胃1 ～100 亿的剂量对小鼠是安全的。

图5 3 种组合饲料经枯草芽孢杆菌BL-Y9 处理后消化液中酸溶蛋白增加幅度

表4 各组小鼠的体重、脏器指数及表征观察

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌的抑菌性能 枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂， 饲喂后动物肠道内的大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的数量显著降低，枯草芽孢杆菌在畜牧业疾病治疗中不会产生耐药性和药物残留等问题， 这一优势使得该益生菌产品在控制养殖疾病方面替代抗生素的使用成为可能。 研究表明，枯草芽孢杆菌及其代谢物能显著提高机体抵抗力 （李震，2012）， 减少禽畜发病率， 防治效果已经达到和超过饲用抗生素的疗效，对动物后期的恢复效果最为明显。 张媛媛等（2014）发现，枯草芽孢杆菌PB6 菌株培养液的抗菌谱较广， 对多种病原菌均表现出不同程度的抑菌作用。 对常见肠道致病菌大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、 金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均存在抑菌性，且抑菌效果相近。 陈天游等（2004）发现，枯草芽抱杆菌BS23 对所研究的几种肠道病原菌生长均具有抑制作用， 其中以对抑制致病性大肠埃希氏菌和产毒性大肠埃希氏菌的生长最为明显。 孙瑞锋等（2008）试验表明，枯草芽抱杆菌制剂可显著降低肉鸡肠道中大肠杆菌和沙门氏菌数量。 本研究中的枯草芽孢杆菌BLY9 对猪源大肠杆菌鸡源沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到10 ～13 mm， 对多种常见肠道致病菌具有不同程度的抑菌性， 表明该菌在肠道内能够发挥一定程度的抑制有害菌生长，调节肠道菌群平衡，减少动物疾病发生的作用。

3.2 枯草芽孢杆菌对饲料的消化作用 芽孢杆菌能够分泌活性较强的蛋白酶、 纤维素酶等一系列消化酶， 提高动物机体对饲料的消化利用率，提高动物的生长性能。 研究表明，添加不同剂量枯草芽孢杆菌， 肉鸡平均日增重和料重比均得到极显著改善， 同时也显著提高了整个鸡群的成活率和肉鸡的生产性能（郭瑞萍，2019）。除此之外，饲喂枯草芽孢杆菌，可提高肉鸡的生长性能， 改善盲肠微生物群组成及盲肠中短链脂肪酸的产生， 可应对肉鸡养殖过程中坏死性肠炎（NE）的暴 发和恢复（Aljumaah Mashael 等2020）。 在妊娠后期和泌乳期向母猪的饲料中添加4.0×108cfu/kg 枯草芽孢杆菌PB6 可以缩短仔猪的生育间隔，提高乳猪的生长性能，并改善母猪后期妊娠的肠道健康 （Qianqian Zhang 等，2020）。 饲粮添加枯草芽孢杆菌制剂虽然不影响母猪繁殖性能， 但可增强机体对蛋白质的利用和免疫力，降低仔猪腹泻率（韩丽等，2017）；断奶仔猪日粮中添加0.2%的枯草芽孢杆菌， 可提高断奶仔猪的平均日增重、 平均日采食量及免疫球蛋白含量， 并对提高断奶仔猪的抗氧化性有促进作用（魏立民等，2017）。 枯草芽孢杆菌除了能提高畜禽饲料消化率， 也能增加水产动物消化酶活性， 提高生产性能。 Ziaei-Nejad 等（2006）报道，芽孢杆菌制剂能够增加印度白虾的消化酶活性，提高其生产性能。 本研究枯草芽孢杆菌BL-Y9 在37 ℃液体摇瓶培养24 h，中性蛋白酶、 纤维素酶酶活分别为184.98、9.68 U/mL，均高于刘秀侠等（2017）报道的最高酶活产生菌BLLL-2，具有较好的产蛋白酶和纤维素酶性能，且对三种不同饲料组合的消化效果较好， 其中以对玉米面+豆粕组合消化效果最好，经作用后消化液粗纤维消化率、游离氨基酸增加幅度、可溶性氨基酸增加幅度、 还原糖增加幅度及酸溶蛋白增加幅度均明显提高， 这充分说明枯草芽孢杆菌不仅能促进饲料底物的消化， 同时也能够分解部分抗营养因子， 解除饲料原料本身所含抗营养因子的抑制作用。

3.3 枯草芽孢杆菌的安全性能 枯草芽孢杆菌是安全可靠（GRAS）菌种，目前其作为新型的饲料添加剂已成为研究热点。 本研究对枯草芽孢杆菌BL-Y9 进行3 个不同剂量的小鼠安全性试验，结果表明，经口灌胃1 周不同剂量枯草芽孢杆菌菌悬液之后， 小鼠的活动和采食量没有显著变化，与空白组无显著差异。 而且经解剖后，不同剂量组小鼠的脏器指数均与空白组相比没有显著差异， 表明在供试剂量1 ～100 亿/只内对小鼠是安全的， 为菌株BL-Y9 在实际生产中的应用提供理论支持。

4 结论

枯草芽孢杆菌BL-Y9 对猪大肠杆菌K88、鸡大肠杆菌O78、 鸡白痢沙门氏菌CV33533 及金黄色葡萄球菌C56011 有较好的体外抑菌效果； 发酵上清液中性蛋白酶及纤维素酶活性分别可达184.94、9.68 U/mL；经模拟动物体消化道的试验结果表明, 菌株BL-Y9 对三种不同饲料组合的消化效果较好，其中以对玉米面+豆粕组合消化效果最好。 动物试验结果显示，每只小鼠灌胃1 ～100 亿剂量菌体对小鼠是安全的。