阿魏酸对青贮主要有害微生物作用效果及机理研究

张微微， 马 莹， 袁 媛， 孙 星， 张 汆

（滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239000）

青贮饲料技术随着现代畜牧业的快速发展已得到了广泛的普及（盘道兴等，2018）。 青贮饲料品质直接受青贮中微生物的生长情况调控，其中腐败微生物会造成青贮饲料的腐败变质和经济损失，从而限制了青贮饲料的广泛应用（汪文忠，2017）。 梭菌、酵母菌、霉菌及意外引入的致病微生物是青贮饲料中主要的有害微生物群落， 不仅影响青贮品质，还会对动物的健康造成威胁（张秀丽和刘召乾，2020；倪奎奎，2016）。因此，为了进一步提高青贮饲料的质量，对抑制有害微生物生长的有效举措进行不断地探究。 多年来，通常直接向青贮饲料中添加抑菌剂，例如化学试剂、糖类、酶制剂等（王玉荣等，2017）。 而研究发现，酚类化合物，例如阿魏酸等具有抗菌、抑菌作用（张适等，2017）。

阿魏酸（Ferulic acid），在植物中普遍存在，其pH 相对稳定，具有提高免疫力、抗菌消炎等效用，可被吸收也可被排出，几乎无毒害性，在体内也不会积累，可作为一种较佳的绿色饲料添加剂，在饲料中的应用前景十分广阔（宋凯等，2017）。海拉希等（2017）研究指出，阿魏酸可抑制大肠杆菌等致病菌及11 种引起食品腐败微生物的生长，且阿魏提取物在浓度为0.6%时对于青霉和黑曲霉的抑制效果比较显著， 抑菌效果也随着抑菌浓度的增加和观察时间的延长而越发显著。 阿魏酸可以抑制瘤胃中细菌、原虫、真菌的生长（Soberson 等，2012；Lou 等，2012；Akin，1982），但日粮中添加游离阿魏酸对奶牛的生产指标没有影响（Aguiar 等，2014；Sobern 等，2012）。 吕珍等（2012）研究认为，阿魏酸可以通过使细胞膜结构遭到破坏来抑制其生长而达到抑菌作用，或者细菌N-乙酰转移酶被阿魏酸抑制， 从而影响其合成而达到抗菌效果。宋凯等（2017）研究指出，阿魏酸能抑制与细菌和病毒生存相关酶的活性。

基于以上研究， 本试验旨在研究阿魏酸对青贮中主要微生物的作用效果， 通过研究阿魏酸对酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌活性，检测处理前后微生物生长性能及菌体细胞形态等的变化，阐述抑菌效果，以此为阿魏酸作为天然安全的青贮抑菌剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌分离自玉米秸秆青贮， 保存于滁州学院生物与食品工程学院微生物实验室。

1.2 材料与试剂 考马斯亮蓝G-250，南京杜莱生物有限公司；阿魏酸标准品，北京寰宇科创生物科技发展有限公司；甲醇，广州市信洪贸易有限公司；玉米秸秆青贮，实验室自制。

阿魏酸标准液： 用电子天平称取0.6 g 阿魏酸标准品溶于100 mL 的甲醇溶液， 储存于棕色容量瓶中。

1.3 主要仪器设备 分析天平（BSA124S）、生化培养箱（SPS-150B-Z）、水浴恒温振荡器（SHAB）、 高压灭菌锅（YXQ-LS-75SII）、 低速离心机（TG16-WS）、紫外分光光度计（UV745N）、电导率仪（DDB-303A）。

1.4 试验方法

1.4.1 抑菌效果测定 滤纸片抑菌试验： 制备0.6%的阿魏酸溶液，滴加100 μL 至每片滤纸片，取0.1 mL 菌液于平板上，涂布均匀，放入三片加了阿魏酸的滤纸片， 中间放入加甲醇的滤纸片为对照，静置5 min，放入对应培养箱培养后用游标卡尺测定抑菌圈直径（杨丽等，2018）。

1.4.2 抑菌曲线测定 依据史崇丽和缪锦来（2018）生长曲线法测定阿魏酸对指示菌株生长的影响。 所有处理组定点采样， 以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制抑菌曲线。

1.4.3 阿魏酸剩余含量的测定 采用比色法，以60%的甲醇作空白，在阿魏酸特定吸收峰320 nm下测定吸光度值， 依照标准曲线计算出阿魏酸含量（苏秀兰和杨倚鳞，2016）。

阿 魏 酸 含 量/（μg/g）=（吸 光 度 值-0.0103）/0.0755×体积（50 mL）/样品质量（g）；

阿魏酸标准工作方程为Y=0.0755X+0.0103。

1.4.4 微生物胞外蛋白的测定 依据聂昌宏等（2019）方法将阿魏酸处理的菌悬液与对照组置于培养箱进行培养，定时采样，取1 mL 待测样，加入5 mL 考马斯亮蓝显色剂，静置10 min，于595 nm波长处测定吸光度。

1.4.5 相对电导率测定 将阿魏酸处理的菌悬液与对照组于对应菌株培养箱进行培养， 定时（0、12、24 h）采样，测定培养液的电导率（Karthikeyan等，2016）。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小 滤纸片法可以直观地揭示阿魏酸对于指示菌株有无抑菌效应， 其抑菌效果见表1。 0.6%的阿魏酸对四种指示菌株均具有抑菌活性，效果较为明显。 对酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌圈直径分别为10.41、9.12、8.66、

10.34 mm。 在浓度为0.6%的阿魏酸标准液处理下，酵母菌和霉菌的抑菌圈直径较大，抑制效果显著优于其他两种指示菌株。

表1 抑菌圈直径 mm

2.2 阿魏酸对指示菌株的抑菌曲线 生长曲线可以反映微生物的生长与时间的关系。 用生长曲线法测出的抑菌曲线可以通过直观的比较揭示指示菌株的生长规律与阿魏酸的抑菌能力情况。 菌株的抑菌曲线如图2。 经阿魏酸处理的各指示菌株生长趋势均弱于对照组， 研究结果与Soberon等（2012）报道一致。酵母菌生长总体呈增长趋势，但阿魏酸处理组总趋势均弱于对照组； 丁梭菌0 ～2 h 处于适应期， 速度增长缓慢，2 h 之后慢慢进入对数期，增长速度加快，但阿魏酸处理组缓慢增长并于22 h 进入稳定期； 乙酸菌0 ～5 h 为停滞期，培养8 h 后，对照组9 h 达到顶峰，之后进入稳定期，而阿魏酸处理组一直处于抑制状态，无增长；霉菌由于培养周期长，0 ～24 h 处于缓慢增长状态，而阿魏酸处理组趋势明显弱于对照组。由此可推断，阿魏酸能抑制指示菌株的生长，使其未能形成对数高峰期。

图2 抑菌曲线

2.3 阿魏酸剩余含量的测定 菌株对阿魏酸的利用能力见图3，在酵母菌、丁梭菌、乙梭菌、霉菌生长过程中， 阿魏酸持续被消耗， 作用于指示菌株，抑制其生长。

图3 阿魏酸剩余含量

2.4 阿魏酸对胞外蛋白含量的影响 利用考马斯亮蓝G-250 在酸性条件下和蛋白质结合的原理， 进行可溶性蛋白含量的测定。 试验结果如图4。 各指示菌株胞外蛋白含量总体呈增长趋势，在含有阿魏酸的试验组， 胞外蛋白的含量在试验期间内均低于对照组，结果与吕珍等（2013）相同。阿魏酸处理后，由于菌体处于不利环境，为了抵御环境正常生长， 菌体处于胁迫状态下会将合成蛋白用于修复损伤部位，提高生存率，加之此时阿魏酸可能与相关酶进行结合会影响相关蛋白的产生，使其不能及时修复相关损伤部位， 随之细胞膜的完整性不断遭到破坏，菌体大量裂解死亡，导致胞外蛋白含量低于对照组。经阿魏酸处理后，酵母菌试验组胞外蛋白含量降低了16.4%， 丁梭菌试验组胞外蛋白含量降低了6%， 乙酸菌试验组胞外蛋白含量降低了8.2%，霉菌试验组胞外蛋白含量降低了10.8%。 相比细菌类阿魏酸对于真菌类的抑制效果更为明显。

图4 胞外蛋白的变化

2.5 相对电导率 液体培养基中的电导率一般随着培养的进行而降低， 培养液体系的电导主要由液体中电解质影响（Katrhikeyan 等，2016；Trang等，2009），结果如表2。 指示菌株的生长状况与培养液电导率的变化趋势相反， 随着培养时间的延长，电导率随之下降，试验组相较于对照组均有降低， 说明阿魏酸影响了指示菌株对培养基的利用能力， 对各指示菌株均具有抑制作用。 樊新民等（2006）与雒江菡等（2020）研究表明，菌株的生长情况与培养液的电导率呈负相关， 随着试验的进行，电导率不同程度的下降，从而证明了本试验结果的可信。 在0 时刻电导率不一致的原因可能是不同菌株初始时刻对于阿魏酸的耐受能力有所不同。 培养过程中，阿魏酸作用使得丁梭菌和乙酸菌两种细菌菌体的细胞膜通透性改变，内有细胞内容物流出，改变了培养基的电导率，但是随着培养时间的延长，没有死掉的菌体生长消耗了培养液中的无机盐类，电导率继而又会有不同程度的降低，而且细菌细胞壁的结构改变和细胞膜的通透性程度与阿魏酸浓度相关。

表2 处理组电导率的变化 us/cm

3 结论

本研究发现阿魏酸对青贮中酵母菌、丁梭菌、乙酸菌和霉菌均具有较为强烈的抑制作用。 其抑菌机理可能与延长指示菌株的适应期， 破坏蛋白质的合成，影响指示菌株对培养基的利用能力，干扰菌株生理代谢活动有关。综上所述，阿魏酸对青贮中主要有害微生物均有抑制作用， 但阿魏酸作为青贮抑菌剂，是否影响青贮品质，还需进一步深入研究。