还原氧化石墨烯修饰壳聚糖骨组织工程支架的制备及表征

毕 博，臧圣奇，何懋典，穆 睿，于泓川，刘 鹃，李军霞，陈 博，荣 亮，史小蕾，金 磊

0 引 言

近年来，基于生物材料的骨组织工程(bone tissue engineering，BTE)支架受到了广泛的关注[1-4]。该生物支架材料不仅要有利于干细胞的黏附、增殖和分化，而且还要能与牙槽骨不同形态的缺损部分紧密贴合，确保口腔内软组织的良好愈合[5]。

壳聚糖(chitosan，CS)作为天然高分子化合物，具有来源广泛、无毒、生物活性佳、生物相容性好、易降解等优点。本实验组前期已制备出孔径适中及孔隙率合适的三维多孔壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/GP)支架，但仍存在机械性能不高、降解速率过快等问题[6-7]。近年来大量实验表明可以通过将纳米材料复合在原有支架上以提高其理化性能[8]。还原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)是由氧化石墨烯(graphene oxide，GO)通过还原反应得来，它作为石墨烯的衍生形式之一，具有较大的比表面积和优秀的理化性能。rGO通过去除GO表面大多数的含氧基团以提高自身导电性能来促进干细胞生长[9]，而将rGO引入支架材料可提高原有支架的压缩强度及弹性模量[10]。另外和GO相比，rGO可降低材料的水分散性，提高支架稳定性并减少细胞毒性，具有更高的生物安全性[11]。

对于修复牙槽骨缺损，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作为BTE的标准细胞来源，需要从骨髓中取材，过程过于痛苦且获得的细胞数量有限[12]。与BMSCs相比，人牙髓干细胞(human dental plup stem cells，hDPSCs)取材于第三磨牙或需拔除的健康牙齿的牙髓中，取材过程简便易获得。同时hDPSCs具有更高的自我更新能力和免疫调节能力，克隆形成能力和生长速率更高[13]。另有研究证明hDPSCs可促进动物牙周缺损的组织修复和人牙槽骨再生[14]。基于上述优点，本实验拟选用hDPSCs作为种子细胞。

综上，本研究拟使用rGO对CS/GP支架进行修饰，通过表面形貌观察、孔径及孔隙率计算、机械性能检测及对各组支架的吸水率和降解率分析，探究修饰CS/GP支架的合适浓度，再通过接种hDPSCs，探究引入rGO对复合支架细胞相容性的影响，从而综合评价rGO修饰的CS/GP支架在牙槽骨缺损修复中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

1.1.1 实验试剂天然石墨粉、盐酸(南京医药，中国)；L -抗坏血酸(L-AA)、壳聚糖、β-甘油磷酸钠、溶菌酶(Sigma，美国)；PBS(Gibco，美国)。

1.1.2实验仪器扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S-3400N，日本)；透射电子显微镜(TEM，JEOL JEM-2100，日本)；傅里叶红外光谱仪(FTIR，NICOLET NEXUS870，美国)；电子万能试验机(Instron 3365，美国)。

1.2实验方法

1.2.1rGO的合成和表征采用化学还原法制备rGO，根据改良式Hummers法制备GO粉末[15]，将其超声冰浴下分散到去离子水中，制备出3 mg/mL的GO分散液，按照质量比为L-AA∶GO=10∶1将L-AA加入到分散液中，室温下反应48 h，再用去离子水将上述溶液洗涤至中性，通过冷冻干燥法制备出rGO粉末。将rGO粉末表面喷金后，扫描电镜下观察rGO表面形貌；将rGO粉末分散于无水乙醇中制成rGO分散液，再将分散液滴到碳支持膜铜网上，置于透射电镜下观察；采用KBr压片法制样，将rGO粉末进行傅里叶红外光谱测试扫描范围为500～4000 cm-1。

1.2.2rGO/CS/GP复合支架的制备根据本课题组前期实验方法制备CS/GP复合支架作为对照组，并以此进一步制备 rGO/CS/GP复合支架。即将0.2 g CS(高温高压120 ℃，5 min)加入到9 mL 0.1 mol/L HCl内连续搅拌2 h后，分别加入10、25和50mg的rGO粉末再持续搅拌1 h；将0.56 g β-甘油磷酸钠加入到1 mL三蒸水中，超声冰浴下反应15 min，制成溶液后逐滴加入到rGO/CS分散液中，再放入37 ℃水浴箱内反应10 min使其呈凝胶状态，最后真空冷冻干燥48 h，制得浓度分别为0.1%、0.25%和0.5%的rGO/CS/GP复合支架，另制备不含rGO的CS/GP支架作为对照。

1.2.3复合支架的理化性能检测将4组支架进行相关性能检测，综合对比各项指标，选择合适rGO浓度的复合支架进行后续细胞学实验。①表面形态观察，将支架切成直径10 mm，高5 mm的圆柱形，表面喷金，SEM观察各组样品表面形貌，并根据比例尺测得各组支架的孔径大小。②孔隙率，采用比重瓶法计算各组支架的孔隙率。支架质量为W0，比重瓶内装满无水乙醇的质量为W1，将样品完全浸没入比重瓶内，待排净支架孔隙内的气泡后再次加满无水乙醇，此时质量记为W2，样品取出后剩余无水乙醇和比重瓶的质量记为W3，孔隙率P计算公式如下：

③吸水率，记录干燥状态下支架的质量为W1，在37 ℃下浸泡在PBS中24 h，记录支架湿重为W2，支架吸水率Wa计算公式如下：

④降解率，记录支架的干燥状态下重量为m0，将其放入含有10000 U/L溶菌酶的PBS溶液中，在37 ℃恒温恒湿状态下孵育，分别在孵育1、7、14、21 d后取出支架，用去离子水洗净后40 ℃烘干，测得t时刻下干燥的支架重量为mt，降解率Dt计算公式如下：

⑤机械强度，采用电子万能试验机测量各组支架的压缩强度，加载速率设置为2 mm/min，并绘制应力应变曲线，计算弹性模量结果，比较各组支架的力学性能。

1.2.4复合支架的细胞相容性检测按照文献所述培养hDPSCs[16]。将上述实验中选取的合适浓度的rGO/CS/GP支架和CS/GP支架进行环氧乙烷灭菌(50 ℃，1 h)后置于24孔板中，浸泡在α-MEM培养基后放入37 ℃，5%CO2恒温恒湿细胞培养箱中孵育24 h备用。将生长活力佳、状态良好的第3-4代hDPSCs按照每100 微升中1×105个细胞的细胞密度接种在两组支架上，待6 h后补足10%FBS的培养基连续培养7d，分别在第1、3、5、7天时移走培养基，每孔中加入300 μL MTS细胞增殖工作液，培养箱中孵育4 h，酶标仪490 nm处测得各组的吸光度A值。如上所述接种细胞并在第1、3、5、7天时乙醇梯度脱水、干燥支架后室温下4%多聚甲醛固定20 min，洗涤液漂洗3次，5 min/次；每孔内加入300 μL鬼笔环肽工作液于室温下避光孵育1 h，洗涤液再次漂洗3次，5 min/次，激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架表面的黏附形态。

2 结 果

2.1rGO的合成和表征真空冷冻干燥过的rGO呈黑色絮状粉末，SEM下可见其出现明显的片层结构，周围卷曲形成褶皱样结构，各层间相互交错叠加。TEM下可更明显地观察到rGO的薄层结构，呈半透明状态，选区电子衍射图可见明显的六角衍射光斑。rGO的FTIR显示经过还原后，GO上的含氧官能团，如在1720cm-1的羰基C=O伸缩振动吸收峰完全消失，而3315cm-1的羟基O-H的振动吸收峰，1619cm-1吸附水分子的变形振动峰，1226cm-1环氧基C-O的伸缩振动峰和1060cm-1烷氧基C-O的伸缩振动峰的强度明显减弱，这说明GO中大部分含氧基团被转移，GO被还原。见图1、图2。

图 1 镜下观察还原氧化石墨烯

图 2 还原氧化石墨烯的傅里叶红外光谱图

2.2复合支架的表面形态将上述不同浓度的rGO/CS复合支架在扫描电镜观察可以发现，各组支架均呈现出三维网状结构。其中 CS/GP组支架的网状骨架上较为平整；0.1%rGO/CS/GP组支架的个别网状骨架上可见rGO片层附着其上，但是数量较少，不易发现；0.25%rGO/CS/GP组支架的大多数网状骨架上均可观察到rGO片层的附着，使大多数的网状骨架上均呈现出褶皱状态；0.5%rGO/CS/GP组支架则可以发现很多的网状结构内有多数rGO片层堆叠，堵塞住许多原本的孔状结构。见图3。

a、b: CS/GP；c、d: 0.1%rGO/CS/GP；e、f: 0.25%rGO/CS/GP；g、h: 0.5%rGO/CS/GP

2.3孔径和孔隙率各组支架的孔径大小相差无统计学意义(P>0.05)； 0.5%rGO/CS/GP组支架的孔隙率比CS/GP、0.25%rGO/CS/GP组低(P<0.05)。见图4。

*P<0.05

2.4吸水率rGO的引入提高了复合支架的吸水率，且随着rGO含量增加，吸水率也随之增加，0.1%、0.25%、0.5%rGO/CS/GP吸水率(535.87%±13.21%、621.48%±15.99%、637.19%±11.73%)均高于CS/GP复合支架(343.98%±11.03%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5降解率随着降解时间的延长，各组支架的降解率也不断增加，呈逐渐上升趋势。另外在相同降解时间时，复合支架的降解率随着rGO含量的增加而渐渐下降。其中CS/GP复合支架的降解速率最快，在第7和21天时分别达到46.47%±3.13%和81.35%±0.85%，均高于其余含rGO组支架(P<0.05)。见图5。

*P<0.05

2.6机械强度测定各组支架的应力应变曲线显示随着应变逐渐增加，支架的应力也逐渐加大，并且随着支架内rGO浓度的增加，复合支架的抗压性能逐渐加大。同样复合支架的弹性模量也随着支架内rGO含量的增加而相应增加[CS/GP：(1.10±0.14)MPa；0.1% rGO/CS/GP：(1.24±0.21)MPa； 0.25% rGO/CS/GP：(1.47±0.21 )MPa；0.5%rGO/CS/GP：(1.87±0.25) MPa]，其中0.5%rGO/CS/GP复合支架的弹性模量高于CS/GP支架(P<0.05)。见图6。

图 6 各组支架的机械强度比较

2.7细胞相容性测验MTS结果显示随着时间的延长，hDPSCs在两组支架上均能进行有效地细胞增殖，但是0.25%rGO/CS/GP组的细胞增殖更为迅速，在第5天和第7天时，两组间的增殖差异具有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦显微镜下观察同样发现两组支架上的细胞肌动蛋白被染成亮红色，在两组支架上均附着良好，同时随着时间的增加，两组支架上的细胞数量也逐渐增加。但是在培养相同时间时，CS/GP支架上的细胞附着数量较少，0.25%rGO/CS/GP支架上的细胞更为密集的伸展、附着于支架小梁及孔壁上，这一现象在第5、7天时更加明显，与MTS结果相印证。见图7、图8。

与CS/GP支架比较，*P<0.05

图 8 两组支架的鬼笔环肽染色

3 讨 论

rGO可以由GO通过热还原、电还原或化学还原等方法实现，其中最常见的还原剂是肼，但因其毒性较高而无法用于生物医学领域。L-AA是一种天然的抗氧化剂，无毒易获得[17]，本研究选它作为GO的还原剂，经SEM和TEM观察可见rGO的薄而透明的片状结构，周围卷曲形成褶皱。研究表明，L-AA可通过氧化还原反应来与GO表面的含氧基团如羟基、环氧基结合形成氢键，并通过消除反应进一步还原GO，使C=C共轭体系得到恢复，同时L-AA的氧化产物如古洛糖酸可以通过和rGO表面剩余的含氧基团结合来消除rGO层间的π-π堆积，提高rGO的自身稳定性[18]。FTIR结果同样证实了rGO的成功制备。

在本课题组前期制备的CS/GP支架中，β-GP是形成三维互连网络的关键因素。先前的研究报道，CS/GP交联支架的形成原因可分为以下3种相互作用：①CS和β-GP通过氨基和磷酸基团之间的静电引力；②CS链间氢键；③β-GP可增强CS间的疏水作用。当加入rGO后，除了上述三个相互作用外，在rGO/CS/GP系统中，rGO和CS之间同样存在静电吸引，氢键和疏水相互作用[10]。已有研究证实，CS和rGO之间的氢键及静电相互作用可以在分子水平上诱导更为均匀的三维网络分散系统[19]。

为了探究复合CS/GP支架的合适rGO浓度，根据相关文献查阅及预实验结果，本研究选择分别将0.1%、0.25%和0.5%的rGO与原有支架进行结合。SEM结果显示，0.1%rGO/CS/GP支架组的多孔骨架上rGO附着较少；0.5%rGO/CS/GP支架组的rGO附着较多，有部分堵孔发生；而0.25%rGO/CS/GP支架组的rGO能较为均匀的附着在孔壁表面，呈现出rGO特有的褶皱形态。这些褶皱增加了支架原本的比表面积，同时rGO表面的含氧基团也可提供更多的细胞结合位点从而促进细胞黏附[11]。其次，支架材料的孔径和孔隙率也是评价支架性能的重要指标。单个孔径大于100μm的三维多孔石墨烯材料为细胞附着提供了合适的表面积，且现已证实孔径大小介于70～120μm内的支架有利于促进各种类型的干细胞粘附和增殖，骨组织工程合适的支架孔隙率则介于50%～90%之间[20]。本研究制备的0.25%rGO/CS/GP组支架的孔径为(113.19±46.85)μm，孔隙率为58.99%±25.19%，符合骨组织工程需求。较高的吸水率同样有利于细胞的生长、粘附及增殖。当支架内rGO浓度增加至0.25%时，吸水率为(621.48±15.99)%，较对照组相比有显著提高。支架发挥作用的持续时间则取决于降解速率，因此支架的降解速度应和宿主体内形成新骨的时间相匹配。溶菌酶可以通过水解CS的糖苷键使其降解[21]。在溶菌酶溶液中浸泡21 d后0.25%rGO/CS/GP组支架的降解速率为64.72%±2.24%，低于CS/GP组支架的降解速率。这是由于rGO与CS间的相互作用，纳米rGO片的引入提高了CS/GP支架抗降解的稳定性。另一方面，复合支架的机械性能测试结果显示，0.25% rGO/CS/GP组支架在发生50%形变时，应力可达到0.29MPa，高于单纯CS/GP支架的0.16MPa；弹性模量也从CS/GP组原有的1.10±0.14Mpa提高到(1.47±0.21)MPa。复合支架机械性能的提高归因于rGO表面仍旧存在的少量-COOH和CS的-NH2之间的共价结合；同时rGO较大的比表面积和二维片层结构也可能对CS的链状结构产生更大的几何约束，因此即使rGO表面的含氧基团不多，它也能通过非共价结合以促进CS的大分子链间产生更紧密的机械互锁[22]。

细胞在多孔支架内均匀的分布同样是细胞增殖、分化的有利条件[23]。MTS检测表明随着时间的增加，两组支架上的hDPSCs均有所增加，但是0.25% rGO/CS/GP复合支架组的增殖更快；另外鬼笔环肽染色结果显示随着时间的增加，更多的细胞肌动蛋白被染成红色。这可能与rGO具有优异的导电性，在细胞生长过程中0.25% rGO/CS/GP复合支架可模拟生物电刺激从而促进细胞增殖有关[24]。另外rGO能有效降低活性氧对细胞的损害，从而提高细胞的增殖活力，减少细胞凋亡[25]。

综上所述，本研究成功制备rGO，并将其引入CS/GP支架中，制备了不同浓度的rGO/CS/GP复合支架材料，通过对比各组支架表面形态、理化性能和细胞相容性检测，0.25% rGO/CS/GP组支架可改善机械性能，提高原有支架的吸水率并降低降解速率，同时促进干细胞黏附和增殖，在骨组织工程领域表现出较大的潜力。