柑桔黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实品质的影响

李丹阳，黄霖霄，杨 毅

(1 海南大学，海口，570228；2 贵州大学，贵阳，550025；3 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口，571101；4 农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海口，571101)

琼中绿橙前身是红江橙(Citrussinensis‘Hongjiangcheng’)，于1988年从广东廉江引入海南省琼中黎族苗族自治县进行种植。经过在琼中山区独特的地理环境下长期驯化选育，琼中绿橙成为了海南有浓郁山区特色的名优水果[1]，2008年3月琼中绿橙成为海南省地理标志性产品。琼中绿橙经历了30多年的发展，种植规模逐年增大，同时柑桔黄龙病的防控形势也日益严峻。柑桔黄龙病是一种全球性、毁灭性、检疫性病害[2-3]，患病果树的叶片、果实症状明显，病症因品种不同而存在差异[4-6]。患病果树出现落果严重，产量降低，严重时死亡[7]，果实品质显著下降，果实小、畸形、果皮粗厚、果肉少，口感变差，酸度、异味度明显，维生素C等营养成分含量降低[8-9]。柑桔黄龙病由韧皮部杆菌“CandidatusLiberibacter spp.”引起，在我国主要致病菌为亚洲种“CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas”[10-12]。自然条件下，柑桔黄龙病主要以柑桔木虱作为传毒昆虫介体进行传播[13-15]；带病苗木或接穗的流通，可造成远距离传播[16-17]。目前关于黄龙病菌浓度与果实品质关系的定量研究未见报道。本试验以感染柑桔黄龙病菌的琼中绿橙为材料，通过荧光定量PCR方法分析黄龙病菌浓度对果实内外品质的影响，研究结果为评价黄龙病对琼中绿橙果实品质的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料琼中绿橙果实于2019年12月采自海南省琼中县。采样果园管理栽培措施及环境条件基本一致，树龄14年。果实采自有黄龙病典型症状的植株，一共采摘5株树，将每株树上选定枝条上的所有果实全部采摘。每株树随机选出大小不同的10个果实，一共50个果实进行试验(图1)。

1.2 方法

1.2.1 黄龙病菌浓度检测 称取200 mg新鲜果实的中心柱，剪碎，采用植物DNA提取试剂盒并按照说明书提取中心柱总DNA。采用黄龙病菌亚洲种16S rDNA特异性引物HLBas(5’-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3’)和HLBr(5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’)，荧光探针HLBp(5’-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’)，柑桔中保守的植物细胞色素氧化酶序列的特异性引物COXf(5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’)和COXr(5’-GCCAAAA CTGCTAAGGGCATTC-3’)，COXp(5’-ATCCAGATGCTTACGCTGG-3’)进行荧光定量PCR检测，以判定果实中黄龙病病菌浓度[18]。

图1 部分供试琼中绿橙黄龙病树、病枝和病果

采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。计算公式为：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因；ΔΔCt=ΔCt样品-ΔCt校准品；2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量[19]。本试验中进行相对定量时所选用的校准品来自50个样品，选用其中ΔCt为中间值的样品作为校准品，相对应的-ΔΔCt=ΔCt校准品-ΔCt校准品=0，相对应的病菌浓度的相对表达量=2-△△Ct=1。

1.2.2 外观及内在品质测定 用游标卡尺测量果实纵径和横径，电子天平称单果质量、果皮质量、残渣质量和种子质量，用糖酸折射仪测定果汁可溶性固形物、可滴定酸含量。相关计算公式如下：可食率(%)=[(单果质量-果皮质量-种子质量)/单果质量]×100，果汁率(%)=[(单果质量-果皮质量-残渣质量)/单果质量]×100，种子率(%)=(种子质量/单果质量)×100，果皮率(%)=(果皮质量/单果质量)×100，固酸比=可溶性固形物/可滴定酸，果形指数=纵径/横径。

1.3 数据统计

采用Excel 2019 软件进行数据整理，应用SAS软件求得果实品质各项指标与病菌浓度(相对表达量)的线性回归方程；样品按病菌浓度(相对表达量)分组后，应用SAS软件Duncan方法进行方差分析(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 果实外观品质受到的影响

供试果实的病菌浓度(指相对表达量，下同)范围在0～12.55之间，果实纵径在64.97～57.44 mm之间，果实纵径(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -0.581 6x+ 63.431，R2= 0.163 8，p=0.004<0.05)。病菌浓度>8.00的果实纵径均值比健康果实小11.59%，差异显著(p<0.05)(见表1)。

供试果实的横径在67.35～59.05 mm之间，果实横径(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -0.483 9x+ 65.667，R2=0.114 6，p=0.016<0.05)。不同病菌浓度组间横径无显著差异(见表1)。

供试果实的果形指数在0.83～0.94之间，果形指数(y)随着病菌浓度(x)增加呈现上升趋势(y= 0.005 4x+ 0.848 2，R2= 0.094 8，p=0.030<0.05)。病菌浓度4.00～8.00的果实果形指数均值比健康果实大13.25%，差异显著(p<0.05)(见表1)。

供试果实的单果质量在166.35～109.66 g之间，单果质量(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -3.525 3x+ 153.45，R2= 0.145 2 ，p=0.006<0.05)。病菌浓度>4.00的果实单果质量显著(p<0.05)小于健康果实(见表1)。

供试果实的果皮率在20.33%～19.51%之间，果皮率(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= 0.000 1x+ 0.197 7，R2= 0.000 3，p=0.908>0.05)。不同病菌浓度组间果皮率无显著差异(见表1)。

供试果实的残渣率在20.42%～22.90%之间，残渣率(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= 0.001 8x+ 0.210 4，R2= 0.075 ，p=0.054>0.05)。不同病菌浓度组间残渣率无显著差异(见表1)。

供试果实的种子数量在19.00～12.67粒之间，种子数量(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= -0.212 5x+ 17.923，R2=0.028 3，p=0.243>0.05)。不同病菌浓度组间种子数量无显著差异(见表1)。

供试果实的种子质量在2.69～1.43 g之间，种子质量(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -0.094 2x+ 2.708 2，R2= 0.127 9 ，p=0.011<0.05)。不同病菌浓度组间种子质量无显著差异(见表1)。

2.2 果实内在品质受到的影响

供试果实的果汁率在57.74%～56.47%之间，果汁率(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= -0.001 5x+ 0.573 8，R2= 0.027 2，p=0.236>0.05)。不同病菌浓度组间果汁率无显著差异(见表1)。

供试果实的可食率在78.17%～79.04%之间，可食率(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= 0.000 2x+ 0.785 1，R2= 0.000 7 ，p=0.847>0.05)。不同病菌浓度组间可食率无显著差异(见表1)。

供试果实的可溶性固形物含量在9.78%～8.19%之间，可溶性固形物含量(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -0.163 7x+ 9.899 7，R2= 0.288 1，p=0.000<0.05)。病菌浓度>8.00的果实可溶性固形物含量相对健康果实减少15.13%，差异显著(p<0.05)(见表1)。

供试果实的可滴定酸含量在0.60%～0.66%之间，可滴定酸含量(y)随着病菌浓度(x)增加无明显变化(y= 0.008 3x+ 0.590 9，R2= 0.068，p=0.067>0.05)。不同病菌浓度组间可滴定酸含量无显著差异(见表1)。

供试果实的固酸比在17.09～12.85之间，固酸比(y)随着病菌浓度(x)增加呈现下降趋势(y= -0.484 2x+ 17.46，R2= 0.215 3，p=0.001<0.05)。不同病菌浓度组间果实固酸比无显著差异(见表1)。

表1 黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实内外品质指标的影响

3 讨论与结论

果实外观是果实的重要商品属性，一定程度上影响着果实的市场价值。本研究发现，不同浓度黄龙病菌能够影响琼中绿橙果实外在品质。随着病菌浓度的增加，果形指数变大，果实纵经、果实横径、单果质量、种子质量变小，果皮率、残渣率和种子数量变化不明显。果实按一定病菌浓度分组后进行比较发现，病菌浓度(相对表达量)>8.00的果实纵经显著小于健康果实；病菌浓度(相对表达量)4.00～8.00的果实的果形指数显著大于健康果实，单果质量显著小于健康果实。王飞燕等[20]报道，黄龙病会使沙田柚出现单果质量下降、果皮变薄、种子败育增多等现象，与本试验结果基本一致。韦欣等[21]报道，黄龙病会使纽荷尔脐橙果形指数显著变小，与本试验结果不一致，这可能与柑桔品种不同有关。综上所述，黄龙病对柑桔果实外在品质有显著影响，果实受黄龙病影响程度与感染病菌浓度存在相关性。

柑桔的内在品质是衡量果实品质优劣的重要指标。本研究发现，随着病菌浓度的增多，琼中绿橙果实的果汁率、可食率、可滴定酸含量无明显变化，可溶性固形物含量和固酸比降低。果实按一定病菌浓度分组后进行比较发现，病菌浓度>8.00的果实可溶性固形物含量显著低于健康果实。吴丰年等[22]报道，高黄龙病菌浓度(Ct<26)的沙田柚可食率、出汁率、可溶性固形物含量显著下降。王圣通等[23]报道，黄龙病会使蕉柑果实可溶性固形物变小、可滴定酸含量变大、固酸比变小等现象。这与本试验结果既有一致的地方，也有不一致的地方，可能是试验所用柑桔品种不同所致。陆英等[24]报道，黄龙病会使琼中绿橙果实内在品质下降，与本试验结果基本一致。分析认为，感染黄龙病后的植株韧皮部坏死，筛管堵塞[25]，严重影响光合作用产物的移动，导致叶片中淀粉积累，叶片出现斑驳黄化，叶片的斑驳黄化又进一步影响光合作用，因此，最后会导致果实可溶性固形物含量明显下降。综上所述，黄龙病对柑桔果实内在品质影响显著，果实受黄龙病影响程度和受感染病菌浓度存在相关性。

此外，在本试验所选取的50个绿橙果实中，大部分果实的黄龙病菌浓度偏低，接近健康果实，所测定的内在品质评价指标也都存在一个稳定的范围。本研究还发现，同一株树上绿橙果实内的黄龙病菌含量大致接近，不同株间果实黄龙病菌含量存在明显差异。黄龙病菌浓度对果实维生素C、类黄酮、类胡萝卜素等的影响有待进一步研究。