P45断层塑化技术在应用解剖学研究中的应用

孙诗竹，于胜波，隋鸿锦

大连医科大学解剖学教研室，辽宁 大连 116044

生物塑化技术是上世纪70 年代末德国Hagens[1]发明的一项组织保存技术，已被广泛应用于解剖学、生物学、临床医学和艺术等相关领域。生物塑化过程是将生物组织中的水分和脂类用多聚物替代的过程。根据所用的多聚物不同，分为硅橡胶、多聚化乳胶、聚酯共聚体和环氧树脂4种技术[2]。P45断层塑化技术属于生物塑化中的聚酯树脂技术，由隋鸿锦教授[3]于2003 年发明。运用该技术制作的塑化断层标本具有干燥、无毒、不变形、便于手持观察等特点，还实现了透明化，可原位展示切片内部解剖结构的形态及其相互关系，对计算机断层扫描、核磁共振等现代临床影像学诊断图像进行更好的解读。因此，该技术弥补了传统断层解剖学研究方法不足，为应用解剖学提供了新型研究方法。

1 P45 断层塑化标本的制作流程

P45 断层塑化技术的基本步骤包括切片、漂白、脱水、真空浸渗、固化和切割打磨等[4]。首先，经福尔马林等防腐处理的标本（剔除毛发）低温冷冻，之后用聚氨酯发泡剂包埋，再冰冻2 周，使用大型带锯进行连续锯切。将切好的标本放置于耐丙酮金属网内，用流水冲洗，然后浸入5%双氧水中漂白至预定效果。在-25 ℃环境下依次放入由低浓度到高浓度的丙酮中进行梯度脱水脱脂。置入二氯甲烷中1～2 d 可达到更好透明效果。组织切片放到Hoffen P45 平板箱用P45 树脂浸渗，将平板箱垂直置于常温真空箱中，将真空箱密封后缓慢抽真空，逐渐调低压力直到接近0 mmHg，并维持该压力至平板箱Hoffen P45 树脂中不再出现气泡。将切片连同平板箱放入40 ℃水浴，待其硬化后取出冷却至室温，用曲线锯去除切片组织周边多余部分，而后沿其边缘切割打磨，用羊毛轮打磨光滑，即完成P45 断层塑化标本制作。

2 P45 断层塑化标本与福尔马林保存的断层解剖标本比较

P45 断层塑化标本与福尔马林保存断层解剖标本相比较具有鲜明的优势（表1）。传统福尔马林保存的人体断层薄层标本（简称传统标本）经冰冻、划线、锯切、水洗、保存等步骤制作完成，保存在密封有机玻璃盒内[5]。其标本结构容易移位，甚至遗失，不易分清次序，用线缝牵引则可能破坏组织的完整性。标本体积大、笨重、易破损，标本盒玻璃表面磨损影响观察效果[6]。一旦出现固定液渗漏，挥发出来的甲醛有害健康[6]。P45 断层塑化标本（简称P45 标本）用树脂代替固定液可避免甲醛对人体的刺激和危害，其保存不需标本盒及固定液，标本体积小，重量轻。塑化切片更易存放、长久保存，后期维护简单。P45 断层塑化标本整体干燥轻巧，有利于科研及教学使用，方便在学习和学术交流现场展示。

P45 标本相对于传统标本，切片更薄，有助于在更多层面观察。而且P45 标本切片透明化，透光性好，标本内部各解剖结构显示清晰，可放在X 线阅片灯上观察，也可拿在手里对着光源直接观察。这是传统不透明标本无法实现的。在观察结果记录方面，传统标本在有机玻璃盒中保存无法获得清晰照片，取出后由于是湿的标本液体反光而影响照片质量。另外，断层标本内结构因搬动而易发生移位，也影响观察结果的准确性。传统标本不利于反复观察研究和拍照。而P45 标本实现原位透明观察，可将切片置于X 线阅片灯，用相机拍照，可获得清晰断层标本照片和可靠的实验结果。切片透光度好，结构间无明显阴影和遮挡，切片内部的结构细节均能有效呈现和记录，标本可反复观察和拍照，既方便，又能不断丰富实验观察结果。

3 P45 断层塑化标本对MRI、CT 影像的指导意义

MRI 和CT 是临床常用的断层影像检查方法[7]。CT 检查扫描时间短、后处理技术强大，是临床骨组织的常用检查方法。CT 图像可观察到骨组织呈现高信号，肌肉韧带等软组织呈低信号；因分辨率所限，不能区分骨皮质和松质的边界，对于一些微细结构显示不清。MRI 成像分辨力高，多用于软组织检查[8,9]。MR 序列T1 和T2 信号长短由组织内含水量决定，如患者出现炎症或损伤，则其呈现高信号，而部分损伤可能会表现出分层现象。由于骨组织含水量少，MR 对该组织显示敏感度低。临床上多层螺旋CT 与MR 联合可提高诊断率[10]。但目前CT 和MR 均无法清晰显示精细解剖结构，尤其是软组织。运用P45 标本可行连续观察每个断层精细结构，如骨松质形态和分布、肌和韧带在骨皮质上的附着情况等（图1[11]）。基于此，可运用P45 技术制作符合临床诊断需要层面的断层标本，指导CT 与MR 信号的解读[12]。

4 P45 断层塑化技术在科研中的应用

表1 福尔马林保存的断层解剖标本与P45 断层塑化标本的比较Tab.1 Comparison between formalin sectional specimens and P45 plastinated slices

图1 足矢状位P45 断层塑化切片[11]相较于MR 与CT 信号强度受组织敏感性的影响，P45 切片可大范围清晰准确地观察到筋膜、肌、韧带等软组织和骨密质、骨松质的形态Fig.1 Sagittal P45 plastinated section of the footMR and CT images subject to limitations of gray value.The soft tissue such as fascia,muscle,and ligament,and bony tissue such as compact and spongy bone are showed clearly in P45 plastinated section.The picture quoted from‘P45 technology reveals bow-and-arrow sign in human ankle[11]

4.1 在肌硬膜桥复合体研究中的应用

P45 技术在肌硬膜桥研究方面发挥了重要作用[13]。Zheng 等[14]运用头颈部P45 断层塑化切片研究枕下区域复杂的解剖结构，发现并命名了2 种新韧带，即待命名韧带（TBNL，图2[14]）和椎硬膜韧带，并提出“肌硬膜桥复合体”概念和肌硬膜桥给脑脊液循环提供动力的功能假说，显著推进了肌硬膜桥研究[15～19]。P45 切片作为原位透明塑化保存的断层标本，它在原位显示筋膜、韧带、纤维结缔组织和肌纤维等结构具有显著优势[3,20]。大体解剖技术是破坏性显示手段，同时受解剖操作者主观判断影响，其客观性受到限制。组织学观察比较客观，但观察范围局限，很难大范围观察组织结构的走形，延续和相互关系。而P45 切片能够原位客观保存和展示标本内部精细解剖信息，尤其是纤维性结构的空间分布、走形和附着等特征。该技术在观察尺度上填补了大体解剖和显微切片观察之间的“技术空白区”，是“巨微解剖学”观察和新结构发现的技术创新。

4.2 P45 断层塑化技术在面部整形解剖学研究中的应用

近年来，随着创伤修复和整形外科的迅速发展，尤其是微整形技术的推广应用，迫切需要面部浅层软组织结构的精细解剖学支持。传统标本技术进行结构显示过程中不可避免地会损坏细微结构，且无法实现组织结构的客观完整显示。获得高质量大体解剖标本对于解剖技术要求很高，其准确性会受到人为因素影响。组织学切片技术可用于观察细微结构，但其范围局限。而P45 技术的优势在于既保持了组织结构完整性，也可在较大范围内以高清晰度显示细微结构[21]。应用于面部解剖结构研究可原位从皮肤、皮下脂肪、浅肌腱膜系统（SMAS）和SMAS 下间隙等逐层显示各结构特点，及各层间的毗邻关系。淳璞等[22]用P45 技术对上睑结构进行观察，层次显示清晰，脂肪间隙明确，脂肪间隔的整体分布特征明显，其通过眶P45 标本系统展示了上睑的脂肪组织分布：眶隔前区域的眼轮匝肌后脂肪、穿插走形在眶隔前脂肪的肌下纤维组织、眶隔脂肪，位于眉毛后方的眉脂肪垫；清晰阐明了上睑脂肪的分布类型（图3）[23]。

图2 枕颈部正中矢状位P45 断层塑化切片与同部位大体解剖对照[14]P45 切片可清晰显示待命名韧带（TBNL）的分布,P45 切片相对于大体解剖标本能够清晰、原位展现标本内部结构精细解剖信息。Occi.枕骨 RCPma.头后大直肌 RCPmi.头后小直肌 NL.项韧带 TBNL.待命名韧带AF.TBNL 弓状纤维 RF. TBNL 辐射状纤维 SC.头夹肌Fig.2 Comparission of the median sagittal P45 plastinated section of the occipitusneck and the dissected specimensP45 sheets clearly showed the To Be Named Ligaments.P45 sheets maintain the tissue structure insitu and shows internal precise structure higher clarity.Occi, occipital bone; RCPma, rectus capitis posterior major; RCPmi, rectus capitis posterior minor; NL, nuchal ligament; TBNL, To Be Named Ligament; AF, arcuate fibers of TBNL;RF,radial fibers of TBNL;SC,splenus capitis

图3 上睑矢状位P45 断层塑化切片[23]P45 切片清晰展示上睑结构层次及其形态特点FB.额骨 BF.眉脂肪垫 SF.肌下纤维组织 FM.额肌 OM.眼轮匝肌S.皮肤EL.睫毛T.睑板OS.眶隔PF.眶隔前脂肪OF.眶隔后脂肪LA. 提上睑肌MM. Muller 肌Fig.3 Sagittal P45 plastinated section of the upper eyelidP45 slice clearly showed the structural layers of the upper eyelid and their morphological featuresFB, frontal bone; BF, eyebrow fat; SF, Subfrontal fibrous;FM, frontal muscle; OM, orbicularis oculi muscle; S, skin;EL, eyelash; T, tarsus; OS, orbital septum; PF, preseptal fat;OF,preaponeurotic fat; LA,levator aponeurosis; MM,muller's muscle

4.3 P45 断层塑化技术在科普中的应用

生物塑化技术可使标本内部结构得到充分显示，尤其断层塑化标本可在透明光学状态下观察较大区域标本细微结构，为生物标本的科普展示开辟了全新的境界，同时还为生命科学普及提供崭新的视角和丰富的素材。隋鸿锦等[24～26]主编的生命奥秘丛书（《达尔文的证据》、《深海鱼影》和《人体的奥秘》）以达尔文进化论为导引，利用生物塑化技术制作大量海洋、陆地脊椎动物和人体标本生动地呈现给广大读者。书中大量应用P45 断层塑化标本图片，精美而细致展现人和动物身体内部的精细结构，从比较解剖学的角度，揭示了生物多样性、变异性与统一性。该丛书所实现的创造性生命科普成就获得国家科技进步二等奖。

5 小结和展望

基于P35、P40 技术的P45 塑化断层技术改进了前二者的缺陷[27,28]，是组织切片保存新技术，P45 标本除具有塑化标本的干燥无味、方便耐用等优势[29]，还减轻了材料变形缩水难题，使标本更接近自然状态。该技术对标本进行脱水脱脂使其更加清晰透明[30]，可更加真实客观地观察肌肉和纤维结缔组织的“起止-走径”及各个组织结构间的连结与毗邻关系，尤其适用于对纤维组织从“大体”到“微观”的形态学观察，是将组织学与解剖学紧密结合的新型观察方法[4]。CT、MR 等临床影像检查法因各组织成像敏感度不同，呈现低信号组织的形态可能显示不完全，而使图像无法整体性地显示各组织层次。而相同平面的P45 标本可作为CT、MR 信号解读的解剖学依据，更好地理解解剖部位及周围组织连系，提高诊断准确度。

总之，P45 断层塑化标本是断层标本本质的变革，完成了断层标本与CT、MR 断层扫描的有机统一，实现了生命科学研究“死-活统一”、“宏-微统一”和“2D-3D 统一”的3 统一特征和技术优势，开启了临床解剖学研究的新时代。