STAT3在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用

余 旺， 章礼久， 路 燕， 宋莎莎

安徽医科大学第二附属医院 消化内科， 合肥 230601

药物性肝损伤是严重且致命的药物不良反应，对乙酰氨基酚(APAP)引起的肝损伤占药物性肝损伤病例总数50%以上[1-2]。APAP是一种临床常用的解热镇痛药物，当人体过量服用时，APAP代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺与肝细胞蛋白结合，进而引起肝损伤[3]。APAP引起肝损伤的机制包括线粒体损伤、氧化应激、炎症损伤以及免疫相关机制等[4-7]。肝再生对于药物性肝损伤后肝衰竭患者的生存至关重要[8]。信号传导及转录活化因子3(STAT3)不仅是肝损伤时介导炎症的分子，同时也是肝再生过程中的关键信号分子。有文献[9-10]报道，STAT3信号分子在小鼠部分肝切除术后肝再生中有一定的作用。Jung等[11]及Río等[12]研究表明STAT3信号分子在CCl4诱导的大鼠肝损伤模型中参与肝细胞的增殖。而STAT3是否在APAP诱导的肝损伤后肝细胞再生中发挥作用尚不清楚。本研究旨在通过体外实验探究STAT3在APAP致急性肝损伤后肝细胞增殖过程中的作用，为APAP所致急性肝损伤后的再生修复提供可能的治疗依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 小鼠正常肝细胞来源的AML12细胞系购自美国ATCC细胞库；DMEM-F12培养基、insulin-Transferrin-Selenium购自美国Gibco公司；AG490 购自中国MedChemExpress公司；APAP、DMSO购自美国Sigma公司；CCK8试剂盒购自中国Biosharp公司； GADPH、p-STAT3抗体购自美国Santa Cruz公司；STAT3、Cyclin D1、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体购自美国CST公司；18S、PCNA、CyclinD1和Ki67特异性引物由上海生工生物公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和分组 使用DMEM/F-12培养基将小鼠肝细胞株AML12于37 ℃、5% CO2培养箱中进行孵育，2～3 d 换液1次。取对数生长期AML12细胞，加入不同浓度APAP(1、2.5、5、10、20 mmol/L)作用12、24或48 h，等体积PBS作为对照组，采用CCK8、RT-PCR实验检测APAP对AML12细胞增殖的影响，筛选出最适作用时间和浓度。取对数生长期AML12细胞，AG490(10、50、100 μmol/L)作用2 h后，加入APAP继续作用48 h，采用CCK8、Western Blot、RT-PCR法检测AG490对AML12细胞增殖的影响。

1.2.2 CCK8实验检测AML12细胞的活力 AML12细胞常规复苏、传代、培养，待细胞生长至对数生长期时，胰酶消化后用DMEM/F-12 培养基重悬细胞，密度1×105/ml。采用移液器按每孔100 μl将以上细胞悬液加至96孔板中。接种24 h后细胞贴壁完全，弃去细胞上层培养液。实验孔分别加入100 μl预先配制好含不同浓度APAP的细胞培养液，APAP的浓度梯度设置如下：1、2.5、5、10、20 mmol/L。对照孔及空白对照孔均加入等体积DMEM/F-12培养基。每组设置5个复孔。培养箱中孵育12、24、48 h后加入CCK8试剂10 μl，继续培养90 min后放至酶标仪上，在450 nm波长下测定各孔吸光度(absorbance,A)值。重复3次实验。细胞活力的计算公式：细胞活力(%) = (实验组A450 nm - 空白对照组A450 nm) / (对照组A450 nm - 空白对照组A450 nm) ×100%。不同浓度AG490(10、50、100 μmol/L)对AML12细胞活力的影响方法同上。

1.2.3 RT-PCR法检测增殖相关基因mRNA的水平 取对数生长期AML12细胞，胰酶消化后制备成5 ml(1×105/ml)重悬液移至25 cm2培养瓶中，培养箱培养24 h后更换培养液。分别加入2.5 mmol/L APAP刺激AML12，于 24、48 h后收取细胞。先用PBS将瓶中细胞冲洗2遍弃去上清，再加入1.5 ml TRIzol裂解液提取细胞总RNA，随后用罗氏法完成细胞RNA的逆转录，合成cDNA，放至-80 ℃冰箱保存。扩增用LightCycle-480 PCR仪(Roche，version 1.5.0)，按95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s三步法循环扩增50次，循环结束后通过溶解曲线检测PCR扩增产物特异性，以18S作为 PCR 扩增实验的内对照，按2-ΔΔCt法计算目标基因相对比值。RT-PCR检测AG490对APAP损伤的AML12细胞增殖相关基因mRNA的水平方法同上。实验中扩增所用引物序列具体见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 Western Blot检测AML12细胞中STAT3及增殖相关蛋白的表达 取对数生长期AML12细胞，胰酶消化后制备成10 ml(1×105/ml)重悬液移至10 cm2培养皿中，培养箱培养24 h后更换培养液。AG490作用2 h后，加入APAP继续作用48 h，处理结束时AML12细胞弃去培养液后，先用PBS冲洗细胞2次后弃去上清，再加入RIPA裂解液提取细胞的总蛋白，使用BCA试剂盒及酶标仪进行蛋白定量。灌胶，垂直电泳(浓缩胶55 v，50 min；分离胶110 v，1 h)和水平电泳(200 mA，2～3 h)后蛋白即可转到PVDF膜上，牛奶封闭4 ℃过夜，接着用一抗室温孵育1.5～3 h(GADPH 1∶100 000、STAT3 1∶1000、p-STAT3 1∶1000、PCNA 1∶5000、Cyclin D1 1∶1000)，结束后用TBST洗涤5次，每次7 min。用二抗[兔抗小鼠IgG(1∶40 000～1∶60 000)]在摇床上室温孵育洗涤好的PVDF膜1 h左右。用Tanon化学发光显影仪检测各种蛋白表达水平，在电子成像系统中拍摄图片，整理后采用IPP 软件分析各目的蛋白条带的光密度值，标化后进行定量分析。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由安徽医科大学实验动物伦理委员会审批，批号：20180080，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 不同浓度APAP对AML12细胞活力的影响 APAP作用24 h及48 h后，与对照组比较，各浓度APAP组AML12细胞活力均降低(P值均<0.05)(表2)。APAP浓度为2.5 mmol/L时，细胞活力分别为0.717±0.027、0.752±0.014，与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，能够满足后续实验条件。

表2 CCK8检测APAP对AML12细胞活力的影响

2.2 APAP对AML12细胞增殖相关基因mRNA水平的影响 取对数生长期细胞，设置对照组、APAP(2.5 mmol/L)组，分别作用24 h和48 h，采用RT-PCR法检测肝细胞增殖相关基因mRNA水平的变化。结果显示，与对照组比较，24 h APAP组PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均降低(P值均<0.01)；48 h APAP组Ki67 mRNA的水平升高(P<0.01)。与24 h APAP组比较，48 h APAP组PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均升高(P值均<0.01)(表3)。因此，本研究采用APAP2.5 mmol/L、刺激时间48 h来模拟体外损伤AML12细胞后肝细胞再生的模型。

2.3 AG490对AML12细胞活力的影响 取对数生长期细胞，分别加入0(对照组)和10、50、100 μmol/L AG490，作用2 h后加入2.5 mmol/L APAP继续作用48 h，采用CCK8法检测AG490对AML12细胞及APAP损伤后的AML12细胞活力的影响。结果显示，与对照组比较，10、50 μmol/L AG490组细胞活力变化无统计学意义(P值均>0.05)，余各组细胞活力均降低(P值均<0.01)；与APAP 2.5 mmol/L组比较，APAP 2.5 mmol/L+AG490 50 μmol/l组和APAP 2.5 mmol/L+AG490 100 μmol/L组细胞活力降低(P值均<0.01)(表4)。因此选择50 μmol/L AG490作为后续实验处理浓度。

表4 AG490对AML12细胞及APAP损伤后的AML12细胞活力的影响

2.4 Western Blot检测AML12细胞中STAT3、p-STAT3及增殖相关蛋白的表达 为进一步探讨AG490对APAP诱导AML12细胞损伤后增殖降低的可能作用通路，采用Western Blot法检测STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果显示，与对照组比较，APAP组p-STAT3的蛋白表达上升，AG490 组、APAP+AG490 组p-STAT3的蛋白表达下降(P值均<0.05)；与APAP组比较，APAP+AG490组p-STAT3的蛋白表达下降(P<0.01)(图1，表5)。

Western Blot法检测增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1的表达情况，结果显示，与APAP组比较，APAP+AG490组中PCNA、CyclinD1蛋白表达均降低(P值均<0.05)(图2，表5)。

图1 Western Blot法检测AML12细胞中STAT3、p-STAT3蛋白表达情况

图2 Western Blot法检测AG490对APAP损伤的AML12细胞PCNA、CyclinD1蛋白表达的影响

表5 Western blot检测AML12细胞中STAT3及增殖相关蛋白表达情况的定量分析结果

2.5 RT-PCR检测AG490对APAP损伤的AML12细胞中增殖相关基因mRNA的水平 从mRNA水平探究AG490对APAP诱导AML12细胞损伤后增殖降低的原因，采用RT-PCR法检测肝细胞增殖相关基因mRNA水平的变化。RT-PCR结果显示，与APAP组比较，APAP+AG490组PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均降低(P值均<0.01)(表6)。

表6 RT-PCR法检测AG490对APAP损伤的AML12细胞中增殖相关基因mRNA的相对表达水平

3 讨论

STAT3是一种重要并且广泛表达的蛋白质，与肝细胞损伤、炎症及肝细胞癌的发展关系紧密[13]。STAT3激活后，通过与胞质内2个磷酸基团结合后，接着进入细胞核内进行信号传导，启动细胞DNA复制等生理过程，从而参与细胞增殖。激活的STAT3可通过调节 cyclin D1 蛋白表达促进细胞有丝分裂，使肝细胞对生长因子产生足够的反应[14]。APAP肝毒性诱导的肝再生涉及多种信号传导介质(包括细胞因子、生长因子、血管生成因子及其他促有丝分裂途径)，而不同介质之间在不同时期具有复杂的相互依赖作用[15]。AG490是一种酪氨酸激酶抑制剂，其能抑制STAT3信号传导。本研究旨在确定STAT3是否在APAP引起肝细胞损伤后再生过程中发挥作用，通过体外实验用APAP对小鼠正常肝细胞AML12造成损伤，加入AG490抑制STAT3通路，观察对肝细胞增殖的影响。

本研究首先通过CCK8实验选择2.5 mmol/L作为APAP的处理浓度，与24 h APAP组比较，48 h APAP组细胞活力升高，说明AML12 细胞在2.5 mmol/L APAP浓度处理48 h时可能出现损伤后再生现象。RT-PCR检测AML12 细胞中mRNA水平发现，24 h APAP组增殖相关基因mRNA表达水平较对照组均降低，48 h APAP组增殖相关基因mRNA表达水平较24 h APAP组均升高，说明APAP损伤AML12细胞后48 h细胞的增殖较24 h明显，因此本研究采用APAP 2.5 mmol/L、刺激时间48 h来模拟体外损伤AML12细胞后肝细胞再生的模型。文献[16]报道，50 μmol/L的AG490能明显下调STAT3磷酸化水平，抑制血管平滑肌细胞增殖。此外，有研究[17]表明50 μmol/L的AG490能够抑制宫颈鳞癌C33A细胞的增殖。故本实验加入不同浓度AG490，CCK8结果提示50 μmol/L AG490对细胞自身活力无明显影响，但(50 μmol/L)AG490+APAP组细胞活力较APAP组降低，因此结合CCK8结果及文献最终选择50 μmol/L AG490作为后续实验处理浓度。PCNA是存在于真核细胞核中的一种多功能蛋白，它作为DNA复制以及DNA修复系统的组成部分发挥着重要作用[18]。Ki67属于细胞核抗原，与细胞分裂周期密切相关，参与细胞增殖。CyclinD1作为细胞周期进程的积极调节者，过表达可能会加速G1/S进程，促进细胞增殖[19]。因此本研究选用PCNA、CyclinD1以及Ki67作为检测AML12细胞增殖的重要指标，同时进一步探讨AG490对APAP诱导的AML12细胞损伤后增殖降低的可能作用通路。通过表5得出,与对照组比较， APAP组p-STAT3蛋白水平上升；与APAP组比较，APAP+AG490组p-STAT3蛋白水平下降，提示STAT3可能参与APAP损伤肝细胞后的增殖过程，而AG490通过抑制STAT3磷酸化阻断此过程。最后通过RT-PCR及Western Blot方法检测发现，加入AG490后，APAP损伤后的AML12细胞增殖相关基因mRNA水平及蛋白表达均降低(P值均<0.01)，证实STAT3参与APAP损伤肝细胞后的增殖过程。

综上所述，APAP诱导AML12细胞损伤后48 h细胞出现明显增殖，STAT3参与APAP诱导的小鼠肝细胞损伤后的细胞增殖，而AG490作为STAT3抑制剂通过抑制STAT3磷酸化进一步抑制肝细胞增殖相关基因mRNA及蛋白水平的表达，从而抑制APAP肝损伤后肝细胞增殖。本实验为APAP致急性肝损伤后的治疗提供理论基础，同时为药物性肝损伤的治疗提供新思路。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：余旺参与课题设计，完成实验，论文写作；章礼久、路燕负责课题设计，指导撰写文章，修改论文并最后定稿；宋莎莎负责数据分析及修改论文。