胆汁中趋化因子C-X3-C-基元受体1和可溶性CD40配体在肝移植术后肝损伤中的预测价值

杨鹏翔，高玉雪，刘 欢，沈昀泰，臧运金，陈德喜,

1 青岛大学 医学部， 山东 青岛 266071； 2 青岛大学附属医院 器官移植中心， 山东 青岛 266003;3 首都医科大学附属北京佑安医院 北京市肝病研究所， 北京 100069

目前肝移植是各种慢性终末期肝病、肝恶性肿瘤的有效治疗方法[1]。在肝移植过程中肝损伤的发生在所难免，由于供体肝切取、冷保存、手术再植入以及开放血流再灌注等过程可导致术后初期肝功能不良[2]。肝功能障碍可能是肝移植损伤过程中先天免疫系统引起的全身炎症和氧化应激反应[3]。许多研究[2,4-6]结果显示细胞因子参与肝移植和急性肝损伤后的炎症反应，在肝移植术后肝损伤的发生发展中有重要作用。本研究拟分析肝移植患者胆汁中细胞因子的水平，并结合临床指标探讨其对肝移植术后肝损伤程度的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—12月青岛大学附属医院器官移植中心收治的16例肝移植患者，根据术后第1天ALT水平分为轻度肝损伤组(ALT<500 U/L)和重度肝损伤组(ALT>500 U/L)。

1.3 主成分分析(principal component analysis，PCA) 对胆汁中细胞因子以及胆汁中细胞因子与临床指标结合进行PCA分析，明确胆汁中细胞因子和临床指标对肝损伤程度的影响。

1.4 GO富集分析 GO分析是对细胞因子功能注释以及识别生物学特性的生物信息分析方法。采用R语言中的clusterProfiler包对胆汁中细胞因子进行GO富集分析。

1.5 伦理学审查 本研究方案经由青岛大学附属医院伦理委员会审批，批号：QDFYKYLL-2018-12-008，患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 16例肝移植患者中，男12例，女4例，年龄33～61岁。主要肝移植病因：肝癌患者8例，肝炎或肝硬化患者7例，肝衰竭患者1例。轻度肝损伤组10例，重度肝损伤组6例。

2.2 不同时间点两组患者血清ALT、AST、LDH水平比较 肝移植术后第1天，重度肝损伤患者AST、ALT和LDH水平均明显高于轻度肝损伤患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。在肝移植术后第1、3、5、7天，AST、ALT和LDH呈逐渐降低的趋势，且AST较ALT更容易恢复正常(表1)。

表1 不同时间点两组患者ALT、AST、LDH水平变化

2.3 两组患者胆汁中细胞因子水平比较 肝移植术后第1天，重度肝损伤组患者的趋化因子C-X3-C-基元受体1(Fractalkine)、可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40L)、IL-4、趋化因子CXCL10(chemokine CXCL10，IP-10)和巨细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein 1 alpha，MIP-1α)表达水平明显高于轻度肝损伤组，差异均有统计学意义(Z值分别为-2.828、-2.850、-2.398、-2.475、-1.844，P值分别为0.003、0.008、0.017、0.023、0.043)(表2)。

表2 轻度肝损伤与重度肝损伤胆汁中细胞因子比较

2.4 预测肝移植术后肝损伤程度的ROC曲线分析 结果显示Fractalkine、sCD40L、AST的ROC曲线下面积分别为0.933(0.812～1.000)、0.833(0.589～1.000)、0.917(0.779～1.000)，提示术后第1天胆汁中Fractalkine和sCD40L以及AST对肝移植术后肝损伤程度有明显预测价值。

2.5 临床指标与胆汁中细胞因子的关系 相关性分析结果显示，肝移植术后第1天，AST、ALT和LDH与胆汁中多个细胞因子呈正相关(P值均<0.05)(表3)。

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表3 临床指标与胆汁中细胞因子的相关性

2.6 胆汁中细胞因子和临床指标对肝损伤程度的影响

PCA分析结果显示，肝移植术后第1天胆汁中细胞因子结合血清中ALT、AST水平可以将肝移植术后轻度与重度肝损伤患者较好地进行区分(图1)。

注:a, 胆汁中细胞因子; b, 胆汁中细胞因子结合临床指标。图1 PCA结果分析

2.7 GO富集分析 GO分析结果显示， 胆汁中细胞因子与外部刺激的正反馈调节、细胞趋化性、受体配体活性、细胞因子活性、细胞因子-细胞因子受体相互作用有关(图2)。

注:a, 生物过程; b, 细胞组分; c, 分子功能。图2 GO富集分析结果

3 讨论

肝移植术后肝损伤是肝移植失败的重要原因之一[7]。肝损伤所导致的急慢性炎症反应对肝移植手术的成功起着至关重要的作用，众多细胞因子与趋化因子参与炎症反应[8]。早发现、早干预肝损伤的发生，对提高肝移植患者生活质量及预后具有重要意义。临床上常见的肝损伤标志物有ALT、AST、LDH[9-10]，早在1956年就发现ALT是肝损伤更好的标志物[11]。相比于AST，ALT在身体其他部位的浓度更低，且能够更加特异地反映肝损伤的程度[12]。研究[12-13]表明，在92%的供体器官中，ALT的峰值<500 U/L，以血浆ALT的水平作为分组依据，可以评价早期移植物的功能和患者的生存率。本研究主要揭示了肝移植术后胆汁中细胞因子在不同程度肝损伤中的变化及其与临床指标的关系，并探究胆汁中细胞因子成分对肝损伤的预测作用。

Fractalkine作为一种趋化因子参与调节炎症和免疫反应，在急性或慢性肝损伤中的水平增高[14-15]。Fractalkine在肝实质细胞的再生和炎症反应中起着调节作用[16]。与同系移植相比，IP-10和Fractalkine在异体移植术后第3天高表达，提示二者在移植后早期的免疫反应中起重要作用[17]。

原发性肝癌患者肝移植后高水平sCD40L与早期病死率密切相关[18]。在非酒精性脂肪性肝病和原发性胆汁性肝硬化中，sCD40L水平与健康对照组相比无显著差异[19]。血清IP-10水平与丙型肝炎肝移植术后早期纤维化相关[20]。促炎细胞因子和趋化因子如Fractalkine、IL-1、IL-4、G-CSF和单核细胞趋化因子-1等可促进辅助性T淋巴细胞17和CX3CR1+单核细胞浸润，驱动小鼠肝损伤的炎症反应[21-23]。本研究显示，肝移植术后重度肝损伤患者胆汁中Fractalkine和sCD40L均高于轻度肝损伤组；IL-4、IP-10、MIP-1α在严重肝损伤时也有升高。Fractalkine与ALT呈正相关，sCD40L与ALT、AST、LDH均呈正相关(P值均<0.05)。联合ROC曲线分析结果显示，术后胆汁中Fractalkine、sCD40L的升高对于肝损伤的早期预测具有提示意义。胆汁中细胞因子水平的升高反映了患者炎症反应的激活，并为预测不同病因移植患者的肝功能潜在异常提供了理论依据。常规的肝损伤指标达检测上限，在时间上存在一定的延后性，随后仅能根据ALT的增加对已发生肝损伤患者进行对症支持治疗[24]，由于肝移植术后胆汁的获取更加快捷便利，因此探究胆汁中更早的无创肝移植术后损伤标志物对于肝损伤的早期预警非常有意义。AST和LDH较ALT，更容易恢复正常，提示肝移植是一种外部刺激，细胞因子及其配体激活，在炎症反应中起重要作用。而胆汁中细胞因子与外部刺激的正反馈调节、细胞因子活性、细胞因子-细胞因子受体相互作用等有关。遗憾的是，在这项研究中，没有动态检测血清细胞因子，未能揭示胆汁和血清细胞因子之间的相关性。

总之，该研究提示胆汁中Fractalkine和sCD40L可能是预测肝移植术后肝损伤潜在的标志物。胆汁中细胞因子联合临床指标能更好的预测肝移植术后肝损伤的程度。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：杨鹏翔、高玉雪负责资料分析，撰写论文；刘欢、沈昀泰参与收集标本；臧运金负责指导撰写文章；陈德喜负责课题设计，拟定写作思路，并最后定稿。