巴西橡胶树赤霉素信号转导途径HbRGA1结构和功能分析

陈华峰 樊松乐 王立丰*

（1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室，农业农村部儋州热带作物科学观测实验站，中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101）

赤霉素信号转导途径是赤霉素和它的可溶性受 体 蛋 白GID1 结 合 时，GID1 与DELLA 蛋 白 的DELLA 和VHYNP 结合后，将阻遏蛋白DELLA 在26S 蛋白酶体水解［1］。DELLAs 是陆生植物特有的，属于GRAS 转录调控子家族［2］。它是赤霉素信号的负调控因子。缺失该基因的拟南芥和水稻突变体会产生促进生长发育的表型。DELLA 功能与其结构、翻译后修饰、下游转录调控靶基因和蛋白互作相关［3］。在模式植物拟南芥中已经鉴定了GAI、RGA、RGL1、RGL2 和RGL3 五个DELLA［4］。其N 端和C 端分别含有DELLA 和GRAS 超级家族结构域。在其功能研究领域，已证明DELLA 通过蛋白互作方式调控超过300 以上的转录因子［2］。拟南芥DELLA 蛋白与MYB21 和MYB24 结合调控花丝伸长［5］。FKF1 蛋白负调控DELLA 蛋白稳定性促进开花［6］。油菜BnaA6.RGA 与ABA 信号转录因子ABF综和调控干旱抗性［7］。鉴于DELLA 蛋白的重要性，研究人员相继从海棠［8］，苹果［9］等果树，大戟科（Euphorbiaceae）植物珍珠黄杨［10］和蓖麻［11］中克隆并鉴定了DELLA蛋白基因并验证其功能。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）起源于南美亚马逊流域，是重要工业原料天然橡胶的主要来源［12］。橡胶树生长、发育和产量与植胶区环境和植物激素信号密切相关［13］。随着分子生物学在橡胶树研究领域的不断拓展，橡胶树中植物激素信号的调控作用机制不断更新。如揭示橡胶树ABA信号途径的PP2A 家族［14］，bZIP［15］。生长素信号HbJAR1［16］和乙烯信号AP2/ERF［17］等。在橡胶树赤霉素信号研究领域，已经鉴定了HbGAI 基因，并证明其受割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利差异调控表达。在RGL1 的研究领域，发现RGL1 与WRKY45互作激发叶片衰老［18］。鉴于DELLA 蛋白植物生长发育和激素信号交互中的作用，揭示并证明橡胶树中DELLA 蛋白的结构与功能将为研究生长发育和产量形成提供坚实的理论基础。据此，本研究克隆并鉴定HbRGA1 的cDNA 全长序列，利用生物信息学分析预测该基因及其推导的氨基酸序列的结构和特性，并利用荧光定量PCR 技术分析该基因的表达模式，为阐明HbRGA1在橡胶树的生物学功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用中国热带农业科学院橡胶研究所儋州基地国家种质资源圃种植巴西橡胶树主推品种Rey⁃an73397 正常割胶的10 年树龄的茎、叶、胶乳、树皮为材料，用于HbRGA1 的克隆、不同组织的表达分析。白粉病、机械伤害、赤霉素、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、生长素和乙烯利处理参照文献方法［19～20］。

1.2 实验方法

1.2.1 橡胶树叶片提取总RNA和反转录成cDNA

参照TIANGEN 植物总RNA 提取试剂盒的方法，提取巴西橡胶树不同组织和不同处理样品的总RNA，RNA 的浓度与纯度通过Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析仪（Gene Company Limited，上海）检测，后利用TaKaRa 反转录试剂盒发转录获得cDNA，以cDNA 为模板利用PCR 扩 增 内 参 基 因 HbACTIN（Genbank：HQ260674.1）进行验证。

1.2.2 HbRGA1 cDNA全长序列的克隆

根据橡胶树数据库的序列设计引物（见表1）以热研73397 的cDNA 为模板，利用PCR 扩增HbRGA1 的全长序列，使用OMEGA 胶回收试剂盒并参考使用说明对PCR 产物进行回收，连接pMD-18T 载体后转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，在含氨苄抗性培养基上培养，检测后挑取阳性克隆送去赛默飞世尔公司测序。

表1 HbRGA1全长扩增和荧光定量引物序列Table 1 Primer sequences of full-length cloning and qRTPCR of HbRGA1

1.2.3 HbRGA1生物信息学分析及进化分析

利用在线工具SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信号肽，TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构，DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）预测亚细胞定位，PSIPRED V4.09 （https：//github. com/psipred/psipred）预 测 二 级 结 构，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）预测三级结构，SMART：Main page（http：//smart. embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）分析保守结构域，Prot⁃Param（https：//web.expasy.org/protparam/）工具对其理化性质进行生物信息学预测分析。MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在线分析软件对与HbRGA1同源性较高的序列经行motif预测分析。使用DNAMAN9 软件经行多序列对比及同源相似性。使用MEGAX 软件并使用邻接法（neigh⁃bor-joining）经行系统发育分析（bootstrap 值设为1 000）。

1.2.4 不同处理下HbRGA1表达分析

根据HbRGA1 编码蛋白序列设计荧光定量引物（见表1），选用橡胶树HbACTIN 基因为内参，采用SYBR Green 法在伯乐荧光定量PCR 仪进行定量PCR 检测，荧光定量PCR 反应体系和程序参考前人方法［21］。

1.2.5 数据统计分析

Excel 进行数据整理分析，IBM SPSS Statistics进行单因素ANOVA 检验分析差异显著性，Origin Pro2018（Origin Lab Corporation，Massachusetts，USA）软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 HbRGA1的克隆与生物信息学分析

以橡胶树叶片cDNA 为模板，通过PCR 克隆得到HbRGA1 cDNA 全长序列，测序验证正确无误后，并将cDNA 序列命名为HbRGA1 并提交NCBI（GenBank：KM086713）。其长度2 136 bp，包含1 839 bp的ORF。HbRGA1基因编码区的核苷酸和推导的氨基酸序列，共编码613 个氨基酸残基，在49-115是特征性的DELLA蛋白结构域，在254-610处是GRAS 结构域（见图1A）。通过在线分析工具SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析预测HbRGA1 存在信号肽的概率是0.002（见图1B），说明其不含信号肽。利用在线分析 工 具PSIPRED V4.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测HbRGA1 蛋白的二级结构（见图3A）发现存在许多Alpha Helix 和Random coil 结构，利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/in⁃teractive）在线分析工具分析其三级结构与二级结构预测结果相符合（见图1B）。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具在线分析蛋白质的理化性质（见表1），证明其实疏水性蛋白。HbRGA1 与毛果杨PtPOPTR（Populus tricho⁃carpa，XP_002305198），蓖麻RcGAI（Ricinus com⁃munis，XP_002534030），胡 杨PeGAI（Populus eu⁃phratica，XP_011002785），苹果MdGAI-like（Malus domestica，XP_008343058），橡胶树HbGAI（Hevea brasiliensis）进行同源性分析，总相似度达到82.5%9（见图2）。进化分析表明HbRGA1 与橡胶树HbGAI 聚为一类（见图3A）。TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析预测HbRGA1 无跨膜蛋白结构，利用在线分析工具DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）预测HbRGA1 蛋白亚细胞定位，发现定位于细胞核中的概率为0.998（见图3B）。利用MEME 在线分析软件分析橡胶树HbRGA1 与其他植物DELLA 蛋白序列有3 个共同的motif（见图3C）且标注了其在相关序列的位置，motif序列与生物功能密切相关。

表2 橡胶树HbRGA1蛋白质理化性质Table 2 Physical properties of HbRGA1 from H. brasil‐iensis

2.2 HbRGA1的表达分析

通过分析实时荧光定量PCR 数据发现，HbRGA1 在橡胶树树皮、叶片、胶乳和花中均有表达，其中在叶片和花中的表达量较高，叶片的表达量是胶乳中的8倍左右。在树皮和胶乳中HbRGA1的表达量相对较低（见图4）。据此，我们以橡胶树芽接苗为材料进一步分析了在干旱和不同激素处理下的表达规律。从图4可以看出，随着白粉病级别的提高，HbRGA1 的表达量呈持续上升趋势。机械伤害处理的叶片，HbRGA1 的表达量分别在1 和10 h 达到两个峰值，分别为初始0.5 h 的4 和6 倍。赤霉素处理后，HbRGA1的表达量在0.5 h就上调接近12倍，随后呈现下降的规律。

在干旱条件下，HbRGA1 基因的表达量在3 d显著性上升，达到对照的6 倍，之后表达量呈下调趋势。在ABA 作用下，HbRGA1 基因的表达量在0.5～10 h 显著性上调且在10h 达到最高点，之后下调，但仍高于处理前的水平。水杨酸处理后，HbRGA1 的表达量在10～48 h 长时间保持峰值，随后下调。茉莉酸甲酯处理后，HbRGA1 的表达量呈现先上升后下降的规律，在6 h 达到峰值，表达量是对照的6 倍。生长素处理后，HbRGA1 的表达量在6～48 h 呈现峰值，表达量是对照的6 倍。乙烯利喷施处理的叶片中，HbRGA1 基因的表达量在6 h呈现峰值，随后急剧下调并趋于稳定（见图5）。

3 讨论

3.1 HbRGA1是植物DELLA蛋白家族成员

DELLA 蛋白是植物赤霉素信号的转录遏制因子，含有特征性的DELLA 和GRAS 超级家族结构域。DELLA 结构域的序列为DELLAVLGYKVRSSDMADVAQKLEQLEMVMGTAQEDGISYLCSDT ⁃VHYNPSDLSGWVQSMLSELNPPMCLDASG，在 所有植物物种中均保守，DELLA 和VHYNP这两个基序是赤霉素信号受体GID1 蛋白的结合区域。采用缺段突变技术，将RGA 基因的DELLAVL⁃GYKVRSSEMA 敲除后，突变体拟南芥表现出GAI一样的表型，说明DELLA 结构域是DELLA 蛋白行驶功能的重要区域［22］。DELLA 蛋白家族的另外一个结构域是GRAS 也具有DELLA 蛋白的功能，在缺失DELLA 结构域的突变体发挥部分替代功能［23～24］。本研究发现，我们克隆的HbRGA1蛋白分别在49-115 是特征性的DELLA 蛋白结构域，在254-610 处是GRAS 结构域（见图1A），并与其他植物已知的DELLA 蛋白相似度达82.5%以上（见图2），并与橡胶树HbGAI 蛋白聚在一起，说明HbRGA1是植物DELLA 蛋白家族中一员。亚细胞定位显示其定位在细胞核，与F-box 蛋白SLY1 和GID1蛋白等互作［25］。

3.2 HbRGA1 在橡胶树植物激素信号交互中具有重要作用

尽管DELLA 蛋白最早是在赤霉素激素信号研究中发现的，但其被证明参与多种生长发育过程和其他植物激素信号途径［26～27］。例如，拟南芥中乙烯通过调控DELLA 抑制赤霉素生长效应，进而调控拟南芥生长发育［28］。生长素单独调控DELLA 蛋白进而调控赤霉素水平［29］。在茉莉酸信号中，DELLA 蛋白通过与茉莉酸信号阻遏子JAZ蛋白竞争性结合参与调控茉莉酸信号［30］。在植物逆境抗性，冷害诱导因子CBF1 通过调控DELLA蛋白含量调控赤霉素代谢［31］。远红光通过DELLA蛋白刺激的ABA合成抑制萌发［32］。这与本研究的结果一致。在单独逆境和激素处理下，都能上调HbRGA1 的表达量。其中，赤霉素诱导效果最早，在0.5 h 达到峰值（见图4）。干旱、水杨酸和生长素诱导效应最久，可达2～3 天（见图5）。这说明，HbRGA1 在橡胶树中可能参与多种植物激素信号转导过程的交互。这与前人的研究结果一致，如HbGAI 受茉莉酸甲酯和乙烯利诱导差异表达［33］。蓖麻RcGAI 在叶片中表达量高［34］。下一步拟采取构建过表达载体转基因，基因编辑［35］和免疫印迹技术鉴定hbRGA1的互作蛋白和功能［36］。

3.3 HbRGA1 在橡胶树排胶机理与调控技术研究中的应用

巴西橡胶树胶乳来自于位于巴西橡胶树韧皮部的乳管细胞，里面含有线粒体、质体等细胞器，具有割胶后胶乳再生的作用。不同品种具有不同的排胶特性［37］。这些排胶特性的差异是由于里面的差异基因表达决定的［37］。挖掘橡胶排胶的关键功能基因及相关分子标记是天然橡胶产业亟待解决的理论和技术问题。目前，已经证明乙烯通过延长排胶时间促进胶乳产量提升［39］是由于Hev b 7-like 蛋白起到的去凝集作用［40］。作为赤霉素和乙烯激素信号交互的重要调控蛋白［28］，DELLA 蛋白精细的调控两种激素介导的生长发育平衡。本研究发现，HbRGA1 在赤霉素处理前期0.5 h 高表达，随后显著下调表达。乙烯利处理在6 h 显著上调HbRGA1 表达。表明激素信号可能通过时间或空间差异调控DELLA 蛋白基因表达进而调控阻遏蛋白含量，抑制赤霉素信号转导。可采用分析不同品种、不同排胶时间的胶乳代谢组和蛋白组联合分析鉴定HbRGA1 在橡胶树排胶过程中的作用，为研发排胶调控技术提供指导。