丹参体内Sm-miR858对R2R3-MYB转录因子SmPAP1进行靶向负调控作用研究

陈 芳 佘婷婷 张 琳 高浩天 李国梁 王 健，*

（1. 安康学院现代农业与生物科技学院，安康 725000；2. 陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021；3. 教育部药用植物资源与天然药物化学重点实验室和西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，西安 710062）

MicroRNA（miRNA）是一类长度约为22 个核苷酸的内源单链非编码RNA，主要通过切割靶基因mRNA 或抑制靶mRNA 翻译来调控植物个体生长发育、代谢和环境胁迫应答等生理过程［1］。随着在模式植物中对miRNA调控次生代谢途径的研究逐渐深入，越来越多的证据显示miRNAs 在植物，尤其是某些经济类作物以及药用植物次生代谢途径中发挥着至关重要的调控作用。例如，在拟南芥体内，miR156通过对其靶标基因SPL9的下调进而调控花青素、黄酮醇以及倍半萜等活性成分的含量［2～3］；miR159a 通过下调黄酮醇合酶（Flavonol synthase）基 因 调 控 花 青 素、黄 酮 醇 的 合 成［4］；miR828 通过触发ta-siRNAs 的形成下调R2R3-MYB 转录因子基因PAP1、PAP2 以及MYB113 的表达进而广泛调控花青素的合成［5］。在其他植物中，如苹果中miR858通过对其靶标MYB基因家族的下调调控花青素以及原花青素的代谢；红豆杉中miR164 和miR171 对其体内紫杉烷二萜生物合成的调控［6］；长春花中miR5021 以及棉花中miR8156和miR8170对萜类吲哚生物碱合成的调控［7～8］。

丹参是我国传统大宗道地药材，为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根茎。近年来，随着对丹参体内次生代谢合成调控研究的逐渐深入，丹参被视为研究药用植物次生代谢途径的理想材料。丹参体内活性成分酚酸类化合物由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径两条支路共同参与而成［9］。在植物次生代谢途径中，MYB 类转录因子已被证实广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控［10］。目前对丹参酚酸类化合物生物合成途径调控机制的研究主要侧重于探讨相关转录因子参与关键酶基因表达的调控，而转录因子自身表达调控的研究报道较为少见。本实验前期研究发现，与对照株系相比，丹参SmPAP1特异性基因沉默转化株系中酚酸类化合物合成途径中酶基因以及丹酚酸B 等酚酸类活性含量均呈现不同程度的下调［11］。由此推测SmPAP1 作为一个重要的转录因子，参与丹参酚酸类活性物质的代谢调控，但目前关于丹参体内SmPAP1的表达调控机制尚不清楚。

鉴于此，研究选取实验室前期通过对丹参Small RNA 高通量测序获得的一条成熟miR858（命名为Sm-miR858）为对象，首先通过Small RNA Northern blotting 实验验证该Sm-miR858 序列的真实性，然后基于在线软件预测Sm-miR858 的靶标基因，并通过Real-time PCR 分析Sm-miR858 和潜在靶标SmPAP1之间表达水平的负相关性，再通过烟草瞬时表达体系验证Sm-miR858 的表达量对SmPAP1 表达水平的影响，明确丹参体内存在的Sm-miR858对SmPAP1的靶向负调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究所用的植物丹参和烟草幼苗均来自于本实验室的培养。用于构建Sm-miR858 和Sm-PAP1植物表达载体的pCambia1302，大肠杆菌DH5α 和根癌农杆菌EHA105 均来自本实验室。用于overlapping PCR 模板的质粒pRSC300（weigel@weigel⁃world.org.）由中科院遗传所友情赠送提供。cDNA反转录试剂盒Primer ScriptTMRT Reagent Kit、One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 购自中国大连TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表达载体的构建及其在烟草叶片中的瞬时表达

对于Sm-miR858 植物过表达载体的构建，首先利用在线软件WMD（http：//wmd3.weigelworld.org/）设计用于over-Lapping PCR 的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ引物（见表1），然后以质粒pRSC300为模板进行扩增，使其形成合适、对应于载体中拟南芥miR319a与miR319a*之间的“茎环”状二级结构，over-Lap⁃ping PCR 所采用的方法和步骤均严格按照“Clon⁃ing of artificial microRNAs”Protocol by Rebecca Schwab操作方法进行［12］。随后以测序正确的over-Lapping PCR 产物为模板，在引物Ⅰ和Ⅲ两端分别加上BglⅡ和BstEⅡ酶切位点以形成用于PCR 的上游引物（5′CATGGTNACCgaTTCATTGTCTGTTC⁃GACCTTA3′）和上游引物（5′CATAGATCTgaTAC⁃GGTCGAACAGTCAATGAT3′）对Sm-miR858 与Sm-miR858*之间的前体“茎环”状二级结构序列进行再次扩增。其后PCR 产物的酶切及其与pCam⁃bia1302 的连接、重组载体对农杆菌EHA105 的转化均参照文献［13］所描述的方法进行，构建的SmmiR858植物过表达载体命名为35S：Sm-miR858。

对于Sm-PAP1 植物过表达载体（35S：Sm-PAP1）的构建以及包含有重组目的载体农杆菌的活化、摇菌、菌液浓度值的测定、乙酰丁香酮的添加、农杆菌液对烟草叶片的注射等详细操作步骤以及注射后烟草植物的培养条件和时间完全按照文献［14］里面的操作方法进行。

1.2.2 植物RNA 的提取以及Sm-miR858 和Sm-PAP1 mRNA表达水平的检测

实验中植物的总RNA 提取采用盐酸胍法，试剂配制及具体操作程序均参照Bubier 和Schlappi所述方法进行［15］。采用甲醛变性胶进行总RNA提取完整度的检测。对于miRNA 表达丰富的检测，为了减少DNA 的干扰，在反转录之前利用DNaseⅠ对所提取的总RNA 里面残存的痕量DNA 进行去除，然后使用miRNA 加尾及反转录试剂盒对经过纯化的总RNA 里面的miRNAs 进行polyA 加尾反应和反转录，详细操作步骤均按照One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 进行。利用（5′TTCATTGTCTGTTCGACCTT3′）和 通 用 引 物Uni-miR qPCR primer （5′GACTGCGATCTCT CTTTTGTATTCC3′）作为Real-Time qPCR（RT-qP⁃CR）的上、下游引物，丹参及烟草的Ubiquitin 基因作为各自RT-qPCR 的内参照基因；对于Sm-PAP1表达水平的检测，使用常规cDNA反转录试剂盒对经纯化的总RNA 里面的mRNAs 进行反转录以生成cDNAs 链。RT-qPCR 反应程序及温度设定参照“IQTM5 多重实时荧光定量PCR 说明”进行操作，具体引物序列见表1。

表1 Over-lapping PCR和RT-qPCR所用引物序列信息Table 1 List of primers used for Over-lapping PCR and RT-qPCR

1.2.3 Small RNA Northern blotting杂交检测

在电泳上样之前，首先使用50%的PEG 8000以及3.0M 的NaAc 对提取且经过完整度检测的总RNA 进行重新沉淀、富集，以增加样品中miRNAs的浓度。然后配制含有15%尿素的聚丙烯酰胺（PAGE）胶，灌制胶于玻璃槽上，静置1 h 左右。将RNA 样品用2×Small RNA 上样缓冲液稀释，依次将RNA 样品加入到上样孔中，静置5 min。然后用150 V 的电压跑胶1.5 h 左右直至样品到达胶底部，再进行转膜、交联、预杂交、探针的标记、杂交、压片及曝光等操作，具体操作参照Li 等操作方法［16］。实验使用T4PNK 对探针进行P32的同位素标记以增加杂交检测的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 Sm-miR858 序列的保守性分析及其真实性验证

miR858 在相关植物体内的报道并不多见，截止目前，仅陆续在拟南芥、番茄、苹果等植物中被鉴定［6，17～18］，因此，为了研究miR858的序列保守性，本实验将Sm-miR858 和上述物种中的miR858 序列进行比对分析。结果显示（见图1a），7种植物中都具有“UUGUCUGUUCGACCU”这一高度保守的核心序列，但Sm-miR858 的序列长度只有20nt，其它6 种植物miR858 的序列长度均为21nt；与拟南芥miR858 相比，Sm-miR858 除了第4 个核苷酸为A 外，其它位置的核苷酸种类完全一样；与棉花miR858 相比，Sm-miR858 从第1 个到第19 个核苷酸种类完全一样；与其它3 个物种的miR858 序列分别存在2～3 个核苷酸的差异。序列比对结果说明，与其它已经鉴定的miR858相比，Sm-miR858具有高度的序列保守性。为了进一步验证SmmiR858 序列在丹参体内的真实存在，本实验以Sm-miR858 的反向互补序列为探针分别对丹参的根、茎和叶组织进行Small RNA Northern blotting 杂交验证，同时以Sm-miR156 的Small RNA blotting杂交作为阳性对照。杂交信号结果显示（见图1b），Sm-miR858 在丹参的根、茎和叶组织中均有表达，叶中表达水平最高，根中次之，茎中最低，但表达水平均不高，明显低于Sm-miR156 在上述组织中的表达水平，这与研究团队前期丹参Small RNA 高通量测序中显示的不同miRNAs 的Reads是高度一致的，在丹参Small RNA高通量测序结果中，Sm-miR156 有33949 个Reads，而Sm-miR858 仅仅有904 个Reads。基于Small RNA blotting 杂交结果，我们可以确认在丹参体内该Sm-miR858 序列的真实性。

2.2 丹参体内Sm-miR858靶标基因的预测

植物miRNA是通过促进靶标基因mRNA的降解或翻译抑制来负调控靶基因的表达从而实现调控植物的生长发育等功能作用，因此，为了研究Sm-miR858 的功能，我们首先利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）（一款专门对植物miRNA靶标进行预测的在线分析服务器），以最新的丹参基因组编码基因CDS 文库为对象对Sm-miR858 的靶标基因进行预测［19］。在线分析结果显示，Expect 值小于2.5 的靶标基因共有13 个，其中MYB 类转录因子基因10 个，超大鸟嘌呤核苷酸结合蛋白基因1个，另外两个靶基因功能不详。在这些潜在的靶标基因中，有一个R2R3-MYB类转录因子基因Sm-PAP1（见图2a）。该基因是一个重要的参与丹参酚酸类活性物质代谢调控的转录因子基因，与其他物种中已鉴定的miR858靶标基因具有高度的相似性。为了进一步分析Sm-miR858 对靶标基因Sm-PAP1 的准确性，我们挑选了已经过实验验证的拟南芥和葡萄中miR858靶标基因的作用位点并与Sm-miR858的靶向作用位点进行比较分析。位点分析结果显示（见图2b），Sm-miR858 的靶向作用位点位于Sm-PAP1cDNA 的 第290～309 的 核 苷 酸 序 列，AtmiR858 和Vv-miR858 的靶向作用位点分别位于AtMYB104 和VvMYB114 cDNA 序列的第365～385以及第551～571 的片段，这些不同植物中miR858的靶向作用位点在核苷酸序列上具有高度的特异性（见图2c），都编码PGRTDNE这样一段特异的氨基酸多肽序列（见图2d），该多肽序列呈现高度的保守型，均位于R2R3-MYB 基因家族的R3 结构域内。因此，基于上述这些分析结果，我们认为在丹参体内Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶标基因在理论上是可行的。

2.3 丹参体内Sm-miR858 和潜在靶标基因Sm-PAP1之间的表达相关性分析

运用生物信息学手段预测的靶基因仅是理论分析得出的结果，存在一定的假阳性。鉴于在植物生长发育过程中miRNA的表达具有高度的组织及时空特异性，不同组织中miRNA 及其靶基因共表达水平相关性分析的检测便成为miRNA生物学功能研究的重要信息和依据。基于此，为了进一步分析丹参体内Sm-miR858 是否作用于靶标基因Sm-PAP1，利用Real-time qPCR 分别对丹参根、茎、叶及花不同组织中Sm-miR858 和SmPAP1 的组织特异性表达水平进行分子检测。实验结果显示（见图3a），与Small RNA Northern blotting 高度一致，Sm-miR858 在叶中表达水平最高，然后是花及根中，在茎中的表达水平最低，叶中的表达水平几乎是茎中的5 倍；反观SmPAP1 的组织表达水平（见图3b），在茎中最高，随后是根中，叶及花中表达水平均较低，在茎中的表达水平几乎是叶中的4倍。二者在丹参相关各组织中的表达水平之间存在着明显的负相关性。这种表达水平之间的负相关性实验结果也进一步暗示，在丹参体内Sm-PAP1的表达可能被Sm-miR858靶向负调控。

2.4 Sm-miR858 靶向负调控Sm-PAP1 表达的实验验证

尽管通过靶标预测结果和Sm-miR858、Sm-PAP1 二者之间存在的明显表达负相关性均表明Sm-miR858 的靶标基因是Sm-PAP1，但仍缺少直接的实验验证。为了进一步确认在丹参体内存在着Sm-miR858 对Sm-PAP1 基因表达的负调控关系，研究分别构建Sm-miR858 和Sm-PAP1 的植物过表达载体，利用烟草瞬时表达体系将Sm-PAP1植物过表达载体和Sm-miR858 植物过表达载体在烟草叶片细胞中进行瞬时共表达，以检测是否存在Sm-miR858 的过表达对Sm-PAP1 的mRNA 水平进行显著的下调。为了减少实验的误差，随机选取被农杆菌菌液浸润的3 株烟草植株相近部位的多个不同叶片进行总RNA 的提取以进行3 个生物学重复实验，分析在不同的叶片中不同的SmmiR858 表达水平对Sm-PAP1 表达的影响。首先利用Small RNA Northern blotting 检测了在不同烟草叶片细胞中Sm-miR858 的瞬时表达情况，以U6作为总RNA 上样量内参，以检验Sm-miR858 是否能够在烟草细胞中表达以及表达序列的真实性。杂交结果如图4a 所示，在3 泳道中都检测到了杂交信号，表明3 个实验组中Sm-miR858 都有表达，证明构建的Sm-miR858 植物过表达载体中的人工茎环结构在烟草细胞中能够被正确加工、剪切并表达；同时在阴性对照组（仅含pCambia1302 空载体）中无任何杂交信号出现，说明在烟草细胞中不存在与Sm-miR858 一样的内源miRNA 序列存在。但不同实验组中Sm-miR858 的瞬时表达水呈现出一定的差异，2#实验组烟草叶片中Sm-miR858 的表达水平最高，1#组中略微降低，3#组中表达水平最低，推测造成Sm-miR858 植物过表达载体在不同实验组烟草叶片中的表达水平不一致的原因可能跟菌液的浸润程度不一致有关。接下来对3 个实验组烟草组织中Sm-PAP1 及Sm-miR858 的瞬时共表达水平进行了Real-time qPCR 检测。检测结果显示（见图4b），与阴性对照组（仅含35S：Sm-PAP1 表达载体）相比，3 个实验组中Sm-PAP1 的mRNA 水平在Sm-miR858 过表达情况下均出现下降，且Sm-PAP1 mRNA 水平下降的程度与SmmiR858 的表达水平呈显著负相关性，即在2#实验组中Sm-miR858 的表达水平最高，Sm-PAP1 的mRNA 表达水平最低；而在3#实验组中SmmiR858 的表达水平最低，Sm-PAP1 的mRNA 表达水平相对较高，呈现出显著的“剂量效应”。由于在上述烟草瞬时表达实验结果中Sm-PAP1 的mRNA 表达水平直接受Sm-miR858 表达水平的调控，因此，可以证明Sm-PAP1 在mRNA 表达水平上确受Sm-miR858的靶向负调控。

3 讨论

近年来，通过构建小RNA 文库进行直接测序和利用生物学信息法（in silico）已经获得了许多植物物种的不同miRNA 序列，如miR858在拟南芥和其它一些植物物种中已陆续被鉴定。然而大部分miR858 在植物体内的生物学功能仍未知，特别是在一些重要的药用植物如丹参中的生物学功能急需研究清楚。目前对丹参酚酸类活性成分合成途径调控机制的研究主要侧重于探讨相关转录因子参与关键酶基因表达调控上，而对关键转录因子自身表达调控尤其是如何被体内相关miRNA调控的研究报道较少。研究团队前期通过对丹参Small RNA 高通量测序获得了一条在其他植物中已经鉴定出来的miR858高度相似的miRNA 序列，命名为Sm-miR858。丹参是传统大宗道地药材，随着对丹参体内次生代谢合成调控研究的逐渐深入，丹参已被视为研究药用植物次生代谢途径的理想研究材料。但截至目前Sm-miR858 在丹参体内的生理功能尚不清楚，本研究围绕Sm-miR858在丹参体内的生理功能展开研究，为深入研究丹参体内次生代谢合成调控奠定基础。

研究发现miR858 的靶标基因绝大多数都属于MYB 类转录因子，尤其是R2R3-MYB 类转录因子，比如在拟南芥中4个与黄酮类合成密切相关的R2R3-MYB 被miR858 靶向调控，棉花中多达20 个R2R3-MYBs，苹果中66 个MYBs，其中绝大多数都与苯丙烷类代谢途径相关［6，17，20］。除了miR858 对MYB 类基因进行靶向调控外，miR828 也对一些MYB 类转录因子进行调控，并且作用位点均位于MYB 基因的高度保守的R3 结构域对应的核苷酸序列区。MiR858 的作用位点在miR828 作用位点的上游区，并且作用位点对应的核苷酸序列更为保守［6］。在研究miRNA 作用靶标基因预测结果中，显示Sm-PAP1 是Sm-miR858 潜在的靶标基因。有研究表明，Sm-PAP1 是一个重要的参与丹参体内酚酸类代谢途径调控的R2R3-MYB 类转录因子［11］。从不同植物miR858 核心种子区序列比对来看，丹参Sm-miR858和其他已经鉴定的miR858s完全一致。因为miRNA核心种子区与靶标基因作用位点核苷酸序列之间的碱基互补配对状况对miRNA 的剪切或翻译抑制作用是至关重要的，在这个区域序列的差异将直接影响miRNA的剪切或翻译抑制效率。从Sm-miR858 对Sm-PAP1 作用位点来看，其核苷酸序列及其对应的氨基酸保守序列PGRTDNE 也是高度一致的，显示出了不同植物中miR858 功能的高度保守性。根据本实验靶标预测结果显示Sm-miR858 的潜在靶标基因仅有Sm-PAP1，并且在我们的丹参Small RNA 高通量测序结果中也没有相关的miR828 序列出现，这似乎与其他双子叶植物中MYB 类转录因子被miR858和miR828 双重调控现象不一致。我们分析出现这种结果的可能原因有两方面，一方面是研究所提供的丹参cDNA 文库的基因表达信息量不够导致Sm-miR858 的预测靶标没有出现；另一方面可能是丹参Small RNA 高通量测序深度不够没有检测到丹参体内MiR828的序列信息。

总之，论文依次对从丹参Small RNA高通量测序获得的Sm-miR858 进行序列真实性验证、靶标预测以及Sm-miR858 与Sm-PAP1 之间表达相关性等进行了较系统的研究。研究结果证实在丹参体内Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶标基因。这一实验结果为在miRNA水平通过基因工程提高丹参体内关键转录因子的表达奠定了理论基础。

致谢 感谢陕西师范大学王喆之教授在实验构思上所给予的指导和帮助。