农抗211对水稻纹枯病菌细胞膜和抗氧化酶活性的影响

魏丽梅 邹小文 徐婷璐 袁文涛 魏赛金

(江西农业大学应用微生物研究所，江西 南昌 330045)

水稻纹枯病是由担子类立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染水稻引起的重要真菌病害之一[1]。近年来，由于氮肥使用量增加以及田间土壤中菌核数量增多，导致水稻纹枯病广泛传播[2]。目前，化学农药是水稻纹枯病菌的有效防治方法，然而高剂量农药残留，不仅会增加植物病害抗性，而且危害环境，威胁人类健康。随着合成农药的开发和回收成本不断上升，人们更愿意选择以生物方式开发、价格更低廉且环境友好型的防治产品。生物防治能够利用微生物及其所产活性物质来防治植物病害，开发天然生物产品对农业生产、环境保护、人体健康具有重要意义[3]。

研究表明，放线菌会产生大量具有复杂结构和丰富活性的次级代谢产物，是产活性物质最多的一类生防菌。链霉菌属(streptomyces)及其相关类群被认为是主要的放线菌属，广泛用于植物病害生物防治[4-5]。链霉菌能够产生多种抗生素、酶抑制剂、植物激素等活性物质，对提高植物的抗病、抗逆性能具有重要作用[6-8]。如 Harikrishnan 等[9]获得的链霉菌VSMGT1014 的乙酸乙酯提取物具有抑制真菌菌丝生长、孢子和菌核萌发的作用。王岩等[10]发现链霉菌菌株F-1 对水稻纹枯病菌有显著的拮抗作用，其代谢产物导致水稻纹枯病菌顶端菌丝弯曲，菌丝体皱缩畸形。于冰等[11]研究表明淀粉酶产色链霉菌的胞外代谢产物丰加霉素对黄瓜立枯丝核菌的菌丝生长和菌核形成均有明显的拮抗作用。生防链霉菌产生的活性物质能够造成病原菌体氧化，导致细胞内物质大量外渗、细胞原生质体失活，达到抑制病原微生物的作用[12]。目前链霉菌产活性物质作用于真菌细胞膜和菌体抗氧化系统的研究相对较少，链霉菌应用于植物病害防治上的研究也鲜有报道。

链霉菌JD211 是本研究前期分离得到的一株产灰褐色孢子的链霉菌，经鉴定为奈良链霉菌(Streptomyces naraensis)，产环己酰亚胺类物质，命名为农抗211，可显著抑制水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、烟草黑胫病菌、根霉等多种植物病原真菌的生长[13]。李张[14]发现，0.99 μg·mL-1的农抗211 能够促进水稻种子萌发，而62 μg·mL-1的农抗211 则能够提高水稻结实率，增加产量，并且能诱导水稻对纹枯病产生抗性，调控水稻叶片相关抗性酶活和抗逆性物质含量，从而减少纹枯病对水稻的侵害。邵正英等[15]发现将链霉菌JD211 菌剂施入水稻根际土壤后，能有效增加水稻抗性，抑制病原菌的进一步侵染，有效提高水稻对稻瘟病的抗性。虽然关于农抗211 在水稻抗病、促生方面的研究较多，但其对病原真菌抑菌的作用机理尚不明确。本试验通过农抗211 作用水稻纹枯病菌菌丝，旨在明确其对病菌细胞膜及其抗性酶活的影响，为应用链霉菌JD211防治水稻真菌病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:链霉菌JD211(StreptomycesJD211)，由江西农业大学生物科学与工程学院实训基地实验室提供；水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，由江西省农业科学院植物保护研究所惠赠。

农抗211 的制备:参照李张[14]的方法。称取适量的固体菌剂与蒸馏水以质量体积比1 ∶1浸提24 h，8 000 r·min-1离心，上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌得到无菌的农抗211，通过与纳他霉素对水稻纹枯病的对抗试验，可得到农抗211 相应效价浓度为15.8 μg·mL-1，4℃保存备用。

1.2 培养基

马铃薯蔗糖培养基(potato sucrose agar，PSA):去皮土豆200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。马铃薯蔗糖培养液(potato sucrose broth，PSB)培养基:不含琼脂的PSA 培养基。米饭固体培养基:早籼米500 g，葡萄糖5 g，麸皮20 g；先将大米浸泡16 ～24 h，蒸煮成米饭，加入适量葡萄糖均匀拌在米饭中，加入麸皮，加水混匀轻搓，装入蘑菇瓶(500 mL 菌种组培玻璃瓶)中，121℃高压灭菌1 h，备用。

1.3 方法

1.3.1 荧光显微镜观察细胞膜通透性 采用Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA 平板上的水稻纹枯病菌菌块，接种于50 mL PSB 培养液中，于28℃、160 r·min-1振荡培养至对数生长期后，处理组加入备用的农抗211 药液使其终浓度为4.00 μg·mL-1，以等量无菌水为对照(CK)。培养24 h 后取少量菌体加入pH 值7.2 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗数次，每次3 min。用70%乙醇4℃下固定菌丝1 h，再用PBS 漂洗3 次，每次3 min。除去PBS 后，加入0.5 mL 50 μg·mL-1的荧光染料碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，4℃避光20 min。用PBS 冲洗多余的染液。置荧光显微镜于绿光激发波长465 ～495 nm 下观察。每个重复试验中取2 个平行进行观察[16]。

1.3.2 对水稻纹枯病菌胞外电导率的影响 将纹枯病菌接种于PSA 培养基上，28℃培养2 d，用打孔器打取6 块菌丝块，接种于50 mL PSB 培养液中，于28℃、160 r·min-1振荡培养2 d，取出菌丝，用灭菌蒸馏水反复冲洗并抽干水分。称取2 g 洗净的菌丝放入三角瓶中，加入浓度分别为0、0.46、4.00 μg·mL-1的农抗211药液，每处理设置一个药剂对照(CK)，即只含各浓度农抗211 而不加菌丝，置于28℃、160 r·min-1摇床培养，分别于0、2、4、6、8 h 测定电导率。每处理试验重复3 次。

1.3.3 丙二醛含量测定 Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA平板上的水稻纹枯病菌菌块，接种于50 mL PSB 培养液中，于28℃、160 r·min-1恒温摇床培养至对数生长期，处理组加入不同浓度的农抗211 无菌药液使其终浓度为0.63、1.26、2.53、5.06 μg·mL-1，以等量无菌水为对照(CK)，培养48 h，无菌蒸馏水冲掉菌丝上的培养基，用滤纸吸干水分。称取1 g 菌丝，加入2 mL 10%的三氯乙酸，研钵中研磨成匀浆，然后转移至离心管中，再用4 mL 10%的三氯乙酸冲洗研钵，重复2 次，合并提取液。10 000 r·min-1离心15 min 收集上清液。采用硫代巴比妥酸法[17]测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.4 总脂质含量测定 采用磷香草醛法测定不同处理下水稻纹枯病菌总脂质含量[18]，菌丝培养及处理方法同1.3.3。分别称取0.5 g 干燥菌丝在液氮下进行研磨；加入4 mL 甲醇∶氯仿∶水(2 ∶1 ∶0.8，v ∶v ∶v)，剧烈震荡后静置40 min。取出较低相位(下层)含有脂质的混合液与0.2 mL 生理盐水(0.9%)混合，4℃、4 000 r·min-1条件下离心10 min，取0.8 mL 提取液加入到0.2 mL 氯仿和0.2 mL 浓硫酸中，沸水中加热10 min，室温下冷却。向各提取液中分别加入5 mL 磷光体香草醛素，室温下保持10 min。最后用紫外分光光度计在520 nm 波长处测定显色染料的吸光度值。用胆固醇做标准曲线测定总脂质含量。每个处理3 次重复，取均值。

1.3.5 抗氧化酶活性测定 菌丝培养及处理方法同1.3.3，称取1 g 菌丝，加入5 mL 预冷的0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液 [2%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，pH 值7.8]及少量石英砂冰浴研磨成匀浆。4℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液用磷酸缓冲液定量至10 mL 即为粗酶液，用于酶活性测定，水稻纹枯病菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(ployphe-noloxidase，PPO) 活性测定参考文献[19-21]；取0.2 g 菌丝置于研钵中，加10 mL 预冷的0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 值7.0)，于冰上充分研磨后，4℃、10 000 r·min-1条件下离心15 min，取上清液用于水稻纹枯病菌脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性测定，测定方法参考文献[22]；取0.5 g 菌丝，加入2 mL 预冷的0.05 mol·L-1硼酸缓冲液[含5 mmol·L-1巯基乙醇，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和1% PVP，pH 值8.8]及少量石英砂于预冷的研钵中，冰浴下研磨成浆，4℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，上清液即为粗酶液，用缓冲液定量至5 mL，用于苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)活性测定[23]。以上处理测定时均以添加等量相应缓冲液为空白对照用于调零，每组试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 农抗211 对水稻纹枯病菌丝体表面形态及细胞膜通透性的影响

荧光染料PI 是一种能够对DNA 进行染色的细胞核染色试剂[16]，可通过破损细胞或者死亡细胞的细胞膜，与核酸结合染色，荧光显微镜下显现红色荧光。对照组菌丝基本未见荧光；药液处理组菌丝呈现较强的红色荧光。表明经农抗211 处理后，水稻纹枯病菌细胞膜被破坏，通透性增加，PI 染料进入细胞，核酸被染色，细胞膜通透性的改变引起细胞内容物泄露，影响水稻纹枯病菌的正常生长(图1)。

图1 荧光显微镜下菌丝荧光Fig.1 Visualization of hyphae under fluorescence microscopy

2.2 农抗211 对水稻纹枯病菌胞外电导率的影响

由图2 可知，处理2 h 时，0.46 和4.00 μg·mL-1药液处理组胞外电导率分别为53.10、217.67 μs·cm-1，显著高于对照(2.53 μs·cm-1)(P＜0.05)，处理10 h 时，0.46 和4.00 μg·mL-1药液处理组胞外电导率达到最高值，分别为56.43、234.90 μs·cm-1，比处理2 h 分别增加了6.27%和12.96%，随着药液浓度的增加，水稻纹枯病菌胞外电导率也增加，说明农抗211 可作用于水稻纹枯病菌菌丝细胞膜，破坏细胞膜的稳定性。

图2 不同浓度农抗211 对水稻纹枯病菌胞外电导率的影响Fig.2 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on extracellular conductivity of R. solani

2.3 农抗211 对水稻纹枯病菌MDA 含量的影响

MDA 是膜脂质过氧化反应的终产物，是膜脂质过氧化的一个重要指标。药液处理组菌丝MDA 含量随着药液处理浓度的增加而增加，且药液浓度大于0.63 μg·mL-1时，与CK 相比，MDA 含量分别增加了26.63%、54.53%和102.34%，表明一定浓度农抗211能够引起水稻纹枯菌丝发生膜脂质过氧化反应，破坏细胞膜，进而影响细胞凋亡(图3-A)。

2.4 农抗211 对水稻纹枯病菌总脂质含量的影响

脂质是细胞膜的主要成分，具有调节细胞膜流动性和增加细胞膜稳定性的功能[24]。药液处理组菌丝总脂质含量均比CK 低，总脂含量48.46 mg·g-1，经5.06 μg·mL-1药液处理后的菌丝总脂质减少了20.84%。总脂质含量的降低表明脂质结构被破坏，细胞膜的稳定性降低，进一步影响了细胞膜的完整性(图3-B)。

图3 不同浓度农抗211 对水稻纹枯病菌丙二醛含量(A)和总脂质含量(B)的影响Fig.3 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on intracellular malondialdehyde content (A) and total lipids content (B) of R. solani

2.5 农抗211 对水稻纹枯病菌抗氧化酶活性的影响

由表1 可知，与CK 相比，药液浓度为0.63 μg·mL-1时，SOD、CAT 和POD 活性升高；当药液浓度大于0.63 μg·mL-1时，3 种酶活性均随着浓度增加而降低；PPO 活性随着药液浓度增加呈现明显下降趋势；当药液浓度为1.26 μg·mL-1时，PAL 活性明显升高，PAL 和PPO 可维持菌体抗氧化能力。当药液浓度大于1.26 μg·mL-1时，PAL 活性急剧下降，明显受到抑制。药液浓度达到5.06 μg·mL-1时，酶活性与CK相比均受到明显抑制；LOX 活性随着浓度的增大而增大。结果表明，低浓度的药液处理能激活SOD、CAT和POD，高效清除生物体内的活性氧，提高抗氧化能力，同时CAT 活性也增强，催化分解菌体内过量的H2O2，减少氧化伤害，起到防御作用。药液浓度达到5.06 μg·mL-1时，5 种抗氧化酶活性均受到明显抑制，菌体抗氧化系统遭严重破坏，LOX 活性最强，表明膜脂过氧化程度最严重，菌体细胞过氧化严重引起代谢紊乱，细胞逐渐凋亡。

3 讨论

目前关于生防菌产生的拮抗物质对植物病原真菌的作用机制的研究主要是影响真菌细胞壁合成，破坏细胞膜完整性，抑制生物大分子的合成，以及影响细胞能量代谢系统等[12]。细胞膜是抑菌物质抗菌的作用位点之一。本研究中，PI 染色试验表明农抗211 对水稻纹枯病菌细胞膜通透性有影响，菌体细胞膜的透性被破坏，菌丝皱缩。菌体胞外电导率升高，离子外流，破坏了细胞膜的稳定性，胞质外流，菌丝生长受到抑制。这与前期链霉菌702 菌株抗真菌单体组分DZP8作用于水稻纹枯病菌细胞膜结果类似[24]。

表1 不同浓度农抗211 对水稻纹枯病菌胞内抗氧化酶活性的影响Table 1 Effect of different concentration of antifungalmycin JD211 on antioxidant enzyme activity of R. solani

本研究结果表明，随着农抗211 作用浓度增加，细胞膜受到破坏，抗氧化系统被激发，SOD、POD 和CAT活性开始增强，用于缓解膜过氧化反应，保护细胞。SOD 和POD 能够催化超氧化物阴离子自由基反应分解，从而减轻细胞的氧化损伤，提高抗氧化能力[25]。CAT 能够催化细胞发生氧化还原反应所产生的H2O2分解，减少H2O2对细胞的毒害[26]。SOD、POD 和CAT作为抗氧化系统中的重要酶类，其活性在一定程度上能反映细胞的抗氧化能力。本研究发现当药液浓度为5.06 μg·mL-1时，水稻纹枯病菌SOD、POD、CAT、PAL和PPO 防御酶的活性均较CK 显著降低，LOX 活性显著增强，表明抗氧化系统受到严重破坏。LOX 能够参与自由基产生、通透性改变和膜脂质过氧化等过程[27]，其活性能够反映膜脂质过氧化程度。PAL 是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，参与酚类物质和黄酮类物质合成，是一种防御酶[28]；PPO 能转化酚类化合物并氧化脱氢生成邻苯醌[29]，邻苯醌参与物质合成，保持菌体正常生理代谢。PAL 和PPO 在一定程度上也可以反映生物的抗氧化能力。抗氧化系统被激发过程中，细胞总脂质含量降低，MDA 含量不断上升，膜脂质过氧化反应加剧，拮抗真菌效果明显。

4 结论

本试验研究了农抗211 对水稻纹枯病菌细胞膜的作用机制，发现农抗211 对水稻纹枯病菌有较好的抑制作用，其作用机制是有效破坏水稻纹枯病菌菌丝体细胞膜结构的完整性，增加细胞膜通透性，致使胞内物质外泄，脂质含量减少，严重破坏菌体抗氧化系统，从而导致水稻纹枯病菌的菌丝体生长被抑制甚至死亡，从而达到抑制真菌病害的作用。本研究结果为链霉菌JD211 的生物防治应用提供了理论依据。