小麦盐胁迫响应相关ERF基因的分离和初步验证

李世姣 张晓军 乔麟轶 贾举庆 常利芳 张树伟 畅志坚 李 欣

(1山西大学生物工程学院，山西 太原 030006；2山西农业大学农学院，山西 太谷 030800)

土壤盐渍化是影响农作物产量的主要限制因素之一。目前全球遭受盐害的耕地超过8 亿hm2，其中我国盐渍土面积达1 亿hm2[1-2]。随着粮食需求的不断加大，增强作物对盐渍土壤的耐受性进而提高其产量，对于保障粮食安全意义重大。小麦(Triticum aestirumL.)是世界上种植面积最广的粮食作物，广泛发掘小麦耐盐基因、培育耐盐新品种是充分利用盐渍化土壤的有效途径。

隶属AP2/ERF 超家族的乙烯响应因子(ethylene response factor，ERF)在植物应对盐胁迫过程中发挥着重要作用[3]。模式作物拟南芥中，除ERF 以外，AP2/ERF 超家族还包括干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding，DREB)、 PETALA2 蛋 白(PETALA2，AP2)、与ABI3 和VP1 相关蛋白[(related to ABA-insentive3(ABI3)/viviparous1，RAV]和单独亚族(Soloist)[3]等4 个家族。其中，ERF 和DREB 家族序列相似性较高，均包含1 个AP2/ERF 结构域，但DREB 第14 和第19 位氨基酸分别是缬氨酸(V)和谷氨酸(E)，而ERF 则是丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)[3]。目前拟南芥ERF 家族成员ERF1[4]和ERF3[5]被证实可以提高植株耐盐性。此外，水稻(Oryza sativaL.)OsERF922[6]、大豆(Glycine maxLinn. Merr.)GmERF3[7]和GmERF7[8]、番茄(Solanum lycopersicum)TERF1[9]、JERF3[10]和SlERF5[11]、甘蔗(Saccharum officinarum)SodERF3[12]、烟草(Nicotiana tabacumL.)NtTOE3[13]等10 余个盐胁迫响应相关ERF基因已被鉴定。

目前小麦中共有8 个ERF基因被鉴定[14-17]，其中有3 个基因与盐胁迫相关:TaERF1 在小麦受盐胁迫后表达水平上调，过表达TaERF1 的拟南芥植株耐盐性增强[14]；TaERF3 过表达的小麦植株耐盐性增强，病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)干扰植株则表现为盐敏感[15]；而TaERF4 过表达的拟南芥植株对盐胁迫的敏感性增强[16]。其他盐胁迫相关ERF基因的报道还鲜见。本研究从普通小麦全基因组中分离了ERF 家族，通过系统发育分析和转录组数据分析推测可能与盐胁迫相关的ERF 成员，并进行NaCl 处理下的实时荧光定量 PCR ( real time quantitative PCR，RT-qPCR)验证，以期发掘新的小麦耐盐基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料

耐盐小麦材料CH7034(由山西省农业科学院畅志坚研究员选育)和盐敏感品种SY95-71[18]用于盐胁迫处理及RT-qPCR 试验。CH7034 种子萌发后的胚芽鞘以及幼苗的根、茎、叶用于基因组织表达水平分析。

1.2 盐胁迫处理

将小麦种子用1%的双氧水消毒后放置于培养皿中萌发，待胚根伸长至2～3 cm 时，选择长势一致的种子转移到培养箱中的1/2 霍格兰氏营养液中生长，参数设置为16 h 光照/8 h 黑暗，24℃/16℃；待幼苗生长至两叶一心期时更换含250 mmol·L-1NaCl 的营养液进行盐胁迫，在0、6 和12 h 时剪取幼苗根，于-80℃保存，用于RT-qPCR 分析。按上述方法萌发小麦CH7034，在芽期和苗期分别取胚芽鞘和根、茎、叶，于-80℃保存，用于基因组织表达水平分析。

1.3 序列分离与系统发育树构建

利用AP2/ERF 超家族的隐马尔可夫模型文件(注册号:PF00847.20)在nhmmer 软件[19]中检索普通小麦品种中国春IWGSCv1.0 注释蛋白序列(下载自URGI 数据库，http:/ /wheat-urgi.versailles.inra.fr/)，设置E≤1e-5，获得小麦AP2/ERF 序列，将其与109 个拟南芥ERF 家族成员在Clustal X 软件[20]中进行序列多重比对，并用MEGA 6.0 软件[21]构建系统发育树，根据聚类结果以及特征序列分离出小麦ERF 家族。根据NCBI 注册号下载19 个已克隆盐胁迫相关ERF基因的编码蛋白序列，将其与小麦ERF 序列在MEGA 6.0 中构建系统发育树。

1.4 基因表达谱与启动子元件分析

小麦耐盐品种Arg 和盐敏感品种Moghan3 受NaCl 胁迫12 h 后的根部转录组数据[22](注册号:SRP158842)下载自NCBI 数据库(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，利用tophat2 将reads 比对到参考基因组IWGSCv1.0 上，并利用cufflinks 进行转录本组装[23]，之后利用edger[24]获得基因序列的FPKM(expression fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)值。从中检索并筛选表达量差异显著的TaERF 序列，筛选标准为:多重假设检验(FDR)值小于0.01、且｜log2(FPKM[t-t0]/FPKMCK[t-t0])｜≥1。所得结果用MeV tool (http:/ /www.tm4.org/mev.html)输出。

利用PlantCARE 数据库(http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对盐胁迫响应相关ERF基因起始密码子前2 000 bp 的基因组序列进行启动子元件分析。

1.5 RT-qPCR

用RNA 提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)提取样品的总RNA，利用反转录试剂盒(英杰生命科技有限公司)将总RNA 反转录为cDNA。RTqPCR 在罗氏LightCycler © 96-PCR 仪上进行，使用的酶为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京宝日医生物技术有限公司)，内参基因为小麦Tubulin，所用引物列于表1。每个反应重复3 次，所得结果采用2-ΔΔCT法[25]进行分析。

2 结果与分析

2.1 TaERF 家族的分离

利用隐马尔可夫模型文件检索小麦品种中国春数据库得到559 条AP2/ERF 序列，将其与拟南芥AtERF家族进行聚类，共分为7 个组(图1-A)，其中有5 个组(组1～3，组6，组7)包含AtERF成员，从上述5 个组中进一步筛选结构域第14 和第19 位分别为丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)的序列，获得229 条小麦ERFs(图1-B)，在小麦A、B、D 基因组中的数目为70、78 和81，在第1 至第7 同源群分布数目依次为36、45、20、30、34、39 和25 (图1-C)。通过分析A/B/D 同源关系将其归为96 个TaERF成员。

2.2 TaERF 与已知耐盐相关ERF 的聚类分析

对96 个TaERF成员与19 个已报道耐盐相关ERF编码的蛋白序列进行系统发育分析。结果显示，有5 个TaERF成员与耐盐相关ERF聚在同一支中(图2)。其中，TaERF88 和TaERF27 分别是已报道的TaERF1[14]和TaERF3[15]；而TaERF76、TaERF35 和TaERF85 则分别是拟南芥AtERF3[5]、 水 稻OsERF922[6]和簇毛麦(Haynaldia villosa)DvERF[26]的同源基因。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2.3 数据库中TaERFs 对盐胁迫的响应

基于转录组数据库的分析结果显示，TaERF家族中有9 个成员(共18 个ERF 序列)在小麦耐盐品种受盐胁迫后的表达水平变化显著，而在盐敏感品种中变化不显著(图3)。其中，TaERF38 在受NaCl 胁迫12 h后表达量下调，其余8 个成员TaERF3、TaERF27、TaERF28、TaERF55、TaERF56、TaERF64、TaERF67 和TaERF68 在受胁迫后表达量均上调。

2.4 TaERFs 受盐胁迫诱导

基于上述分析结果，与已克隆耐盐ERF基因序列相似性高、或受NaCl 诱导的TaERF成员共有13 个。利用250 mmol·L-1NaCl 对小麦耐盐材料CH7034 和盐敏感材料SY95-71 的两叶一心期植株进行盐胁迫处理，验证这13 个成员在根部的表达量变化。RTqPCR 结果显示(图4)，TaERF27、TaERF35、TaERF55和TaERF64 共4 个基因在耐盐材料中受NaCl 胁迫后显著上调，而在盐敏感材料中无明显变化，可能为盐胁迫响应基因。

2.5 盐胁迫响应相关TaERF 的组织表达水平和启动子调控元件分析

上述4 个盐胁迫响应相关成员的序列信息列于表2。其中，TaERF27、TaERF35 和TaERF64 无内含子，只含有1 个外显子，而TaERF55 含有2 个外显子。

表2 盐胁迫响应相关TaERF 成员信息Table 2 Information of TaERF members related salinity response

图1 基于聚类结果和结构特征从小麦AP2/ERF 超家族中分离ERF 家族Fig.1 Isolation of ERF family from wheat AP2/ERF superfamily based on clustering results and sequence characteristics

对盐胁迫响应相关成员TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐盐材料CH7034 萌发和幼苗阶段不同组织中的表达水平进行分析(图5)，结果显示，上述4 个成员在苗期根和叶中具有较高的表达水平，而在胚芽鞘和茎中的表达量相对较低。其中TaERF35 和TaERF64 分别在苗期根和叶中表达量最高。

随后对4 个成员起始密码子前2 000 bp 基因组序列内包含的调控元件进行分析(图6)，结果显示，上述成员除启动子元件TATA-box 和增强子区域调控元件CAAT-box，还含有参与茉莉酸响应的顺式元件CGTCA-motif、参与脱落酸响应的顺式元件ABRE、生长素响应元件TGA-element、参与水杨酸响应的顺式元件TCA-element 以及赤霉素响应元件P-box。此外，TaERF27 还含有GARE-motif、AuxRR-core、TATC-box元件，TaERF55 还含有GARE-motif、TATC-box 元件，TaERF64 还含有AuxRR-core 元件。各个调节元件功能见表3。

3 讨论

耐盐基因的发掘利用是改良小麦品种耐受性，降低土壤盐害的有效措施。目前小麦中除TaERF1[14]和TaERF3[15]外，还 有HTK[27]、SRO[28]、OPR1[29]和AOC1[30]等几个重要耐盐基因被鉴定。其中，HTK在育种中的应用使小麦在盐碱地上的籽粒产量提高了25%[27]。因此，持续发掘耐盐基因对于保障小麦高产稳产具有重要意义。

图2 TaERF 家族与19 个已克隆耐盐ERF 基因的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of TaERF family and nineteen cloned salinity-tolerance ERFs

图3 耐盐品种Arg 和盐敏感品种Moghan3 受NaCl 处理12 h 后表达水平差异显著的TaERFsFig.3 The TaERFs expressed significantly differently between salt-tolerant Arg and salt-sensitive Moghan3 after NaCl treatment for 12 hours

图4 13 个TaERF 成员在小麦耐盐材料CH7034 和盐敏感品种SY95-71 受NaCl 胁迫处理的表达水平Fig.4 Expression levels of 13 chosen TaERF members in wheat tolerant material CH7034 and sensitive variety SY95-71 after NaCl treatment

图5 4 个盐胁迫响应相关TaERF 成员在小麦耐盐材料CH7034 萌发和幼苗阶段不同组织中的表达水平Fig.5 Expression levels of four TaERF members related salinity response in wheat tolerant material CH7034 at germination and seedling stage

本研究从小麦全基因组中系统地分离了96 个TaERF家族成员，其中有两个是已报道的TaERF基因。TaERF88 与已报道的耐盐基因TaERF1 为同一基因(图2)，但盐胁迫处理后TaERF88 在耐盐品种CH7034 中的表达水平无明显变化，推测CH7034 中可能有TaERF88 的一个新的等位变异，或者受材料遗传背景的影响，导致表达水平的变化；TaERF27 是已报道的耐盐基因TaERF3，研究表明TaERF3 蛋白可通过GCC-box 顺式元件来调控下游应激相关基因，进而提高小麦对盐和干旱胁迫的适应性。本研究通过利用耐盐材料CH7034 和盐敏感材料SY95-71 还鉴定出3 个响应NaCl 胁迫的TaERF，分别是TaERF35、TaERF55和TaERF64，为新的耐盐相关基因。TaERF55 和TaERF64 在CH7034 中受盐处理后表达量上调，在SY95-71 中则无显著变化，这与转录组分析结果一致。TaERF35 是水稻OsERF922 的同源基因，其受盐胁迫诱导后上调，而OsERF922 过表达的植株对盐的耐受性降低[6]，因此初步猜测TaERF35 在植株抵御盐胁迫过程中可能发挥负调控作用，但需要进一步试验证实。

表3 启动子元件及其功能Table 3 The function of the promoter element

本研究初步鉴定的4 个盐胁迫响应相关成员TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐盐材料CH7034 苗期根和叶中均具有较高的表达水平，此外4个成员的启动子区域(-2 000 bp)，除包含TATA-box、CAAT-box 元件外，还含有脱落酸、水杨酸、茉莉酸、生长素和赤霉素等多种植物激素响应元件，这几种植物激素在植物抗旱[31]、抗寒、耐盐[32]以及应答逆境胁迫信号转导[33-34]等过程中发挥着重要作用，推测这些成员可能还参与植物多种非生物胁迫信号转导通路。在本研究基础上，下一步可对TaERF35、TaERF55 和TaERF64 进行功能验证，并评估其在生产中的利用价值。

4 结论

本研究从小麦全基因组中分离了96 个TaERF成员，在A、B、D 基因组中共有229 个拷贝序列；利用RT-qPCR 证 实TaERF27、TaERF35、TaERF55 和TaERF64 在小麦耐盐材料CH7034 中受NaCl 胁迫后显著上调，而在盐敏感品种SY95-71 中无明显变化，推测它们可能为盐胁迫响应基因，其中TaERF27 是已报道的小麦耐盐基因TaERF3。这4 个盐胁迫响应相关基因在CH7034 苗期根和叶中均具有较高的表达水平，此外其启动子区域(-2 000 bp)含有脱落酸、水杨酸、茉莉酸、生长素和赤霉素等多种植物激素响应元件。本研究为培育小麦耐盐品种和探索耐盐分子机制提供了参考信息。