牛妊娠相关糖蛋白16（bPAG16）基因密码子优化及表达

2021-04-19刘长彬卢春霞卢守亮倪建宏

福建农业学报 2021年1期

刘长彬，卢春霞，卢守亮，倪建宏

（1. 新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832000；2. 长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆 408100）

0 引言

【研究的意义】在规模化奶牛养殖生产中，奶牛产犊间隔长、繁殖效率低是影响养殖业发展的主要问题，而对配种后奶牛准确及时地进行早期妊娠诊断，是缩短空怀时间、产犊间隔和提高奶牛繁殖效率重要手段之一。目前，采用免疫分析技术检测血液或奶样中牛妊娠相关糖蛋白（Pregnancy-associated glycoproteins, bPAG）已成为国际上应用最广泛的奶牛早期妊娠检测方法[1−2]，商品化PAG-ELISA 检测试剂盒可对人工授精后28 d 的奶牛进行早期妊娠诊断，并获得较高的准确率[3−4]。但PAG 检测试剂盒主要依赖国外进口，高昂的检测成本（约40 元每头次）限制了其在国内的大规模推广应用。高纯度bPAG蛋白的获得对研发简便、经济、快速的bPAG 检测技术至关重要。【前人研究进展】牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）属于天冬氨酸蛋白酶家族，是由胎盘滋养层细胞合成、分泌的一类糖蛋白。bPAG 基因家族至少有22 个转录本[5]，根据其产生的时间，可分为“古代组”和“现代组”。“古代组”bPAG（bPAG2、8、10-13）由滋养外胚层细胞合成，具有酶活性[5−6]；而“现代组” bPAG（bPAG1、3-9、14-22）仅在胎盘滋养外胚层双核细胞中表达，在进化过程中由于碱基发生了突变而失去酶活性。bPAG 对维持妊娠发挥一定作用，在胚胎附植后不久即迁移到母体外周血中[5−7]，因而常作为妊娠检测的一种生物标记物[2,8]。目前，PAGs 蛋白主要采用溶液提取、硫酸铵沉淀和色谱分离等技术从母畜胎盘子叶中分离纯化而获得[9−10]，但是PAGs 蛋白种类较多，同源性较高，传统的分离纯化方法很难获得单一形式的高纯度PAG蛋白，且工艺复杂。随后研究者利用PAGs 可特异性结合豌豆凝集素[11]、胃蛋白酶抑制剂[12]的特性来分离纯化PAGs，但高的分离成本不利于PAGs 的大量纯化。重组蛋白技术为PAGs 的功能研究及应用提供了新思路，2004 年Patel 等[13]在HEK 293 和CHO细胞中表达了bPAG1 重组蛋白。目前，国内关于bPAG的研究报道极少。薄小辉[14]将bPAG4 基因插入到pET28a 表达载体，通过原核表达系统诱导表达了bPAG4 重组蛋白。【本研究切入点】本团队成功构建了PCDNA3.1（−）-bPAG1、proEM-bPAG4、proEMbPAG9 等多种重组表达载体，通过真核表达系统制备了bPAG1、bPAG4、bPAG9 重组蛋白[15−17]。但迄今为止，尚未见到关于bPAG16 重组蛋白的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究采用密码子优化策略对bPAG16 基因进行了设计和优化，然后通过真核表达系统制备bPAG16 重组蛋白，解决传统的PAG 蛋白分离纯化方法成本高、效率低的问题，为bPAG 抗体的制备和开发相应的早孕检测产品提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ProEM 载体、HEK293、DH5a 菌株来自德泰生物科技（南京）有限公司；Pfu DNA 聚合酶、EcoRI、HindIII 内切酶、T4 DNA 连接酶、dNTP、DNA mark、蛋白Mark、4S Red Plus、小鼠抗6× His 单克隆抗体、琼脂糖、Ni-IDA 蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGR变性丙烯酰胺凝胶试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒等购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Axygen DNA 回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；Gibco®FreeStyle™ 293 表达培养基、Opti-MEM、Gibco®Anti-Clumping-Agent、ECL 化学发光试剂盒等购自Thermo Fisher 公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司。实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Veriti™ 96 梯度PCR 仪（美国ABI）；Essential V4 凝胶成像系统（英国UVITEC）；Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国BIO-RAD）；Powerpac 300 电泳仪（美国BIO-RAD）；Thermo311 CO2培养箱（美国热电公司）；ÄKTA Explorer 100 蛋白纯化层析系统（美国GE 公司）；全波长扫描式多功能读数仪（美国赛默飞）。

依据待检样品标签声称的乳酸菌类别和含量，估算待检样品中是否含有嗜热链球菌及其数量，选择（2～3）个合适的连续稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品稀释液置于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平行。同时分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。然后注入约15 mL冷却至（48±1）℃的MC培养基，转动培养皿使之混合均匀。待培养基凝固后置于（36±1）℃培养箱中需氧培养（72±2）h，培养后计数与计算。

1.3 试验方法

1.3.1bPAG16 基因优化与合成根据GenBank 公布的bPAG16（登录号：NM_176625.1）基因序列，通过在线软件Graphical Codon Usage Analyser 计算bPAG16 基因的同义密码子使用度，分析其密码子使用偏好性。然后利用优化软件MaxCodonTM优化bPAG16，在不改变氨基酸序列的原则下，将HEK 宿主细胞偏好密码子替换目标基因中非偏好密码子，提高密码子适用指数（CAI），改变G+C 含量，同时在优化基因的两端设计EcoRI、HindIII 酶切位点和His 标签，并在EcoRI 酶切位点之后添加保护碱基序列。然后应用 Primer Premier 软件设计18 条引物，首尾引物如下：bPAG16 引物1：5′-AGT TTA AAC GGA TCT CTA GCG AAT TCC CGC CGC CAC CAT GAA GTG GCT GGT GCT CCT GGG ACT GGT GGC TTT CAG CGA GTG CAT CG-3′（下划线为EcoRI 酶切位点），bPAG16 引物18：5′-TTG CCG GCC TCG AGC GGC CGC TAG CAA GCT TAT CAG TGG TGG TGA TGA TGA TGC ACG GCT CTT GCC AGG CCG ATT CTG TCG TTG C-3′（下划线为HindIII酶切位点），其余引物未列出。优化的bPAG16 基因由德泰生物科技（南京）有限公司通过全基因合成法合成。

对照品：磷酸肌酸钠（批号100875‐201302）、肌酸（批号100876‐200901）、三磷酸腺苷二钠（批号140674‐200401）、二磷酸腺苷二钠（批号 140809‐201501）、一磷酸腺苷钠（批号 14719‐200501）、肌酐（批号100877‐200901）均由中国食品药品检定研究院提供。

1.3.3 ProEM-bPAG16 重组载体的转化、筛选与鉴定将连接产物转化到大肠埃希菌DH5a 受态细胞，摇菌培养30 min。取20 μL 菌涂到含有氨苄青霉素（100 μg·mL）的LB 平板上，37 ℃过夜培养，挑取单个菌落进行PCR 鉴定，阳性克隆接种到LB 液体培养基，37 ℃培养16 h 后提取质粒，并进行双酶切鉴定，酶切体系和条件同1.3.2。将鉴定得到的阳性克隆送上海生工生物公司测序，测序结果进行BLAST 比对分析。

一是走进重点整治地区，到群众反响强烈的区域宣传。聚焦涉恶问题突出、群众反映强烈的重点地区、行业领域开展宣传。针对菜园坝地区社情民情复杂，治安形势严峻的特点，区委政法委组织扫黑除恶专项领导小组成员单位分管领导、党员代表、政法干警代表、交通、运输、文化、旅游、城管、房管、卫生等行业代表和居民群众代表在菜园坝北广场开展集中宣传活动。公安干警、社区居民群众现场以群众喜闻乐见的形式表演了自编自导的舞蹈《冲上云霄》、方言快板《全民参与扫黑除恶》等文艺节目。不同行业的从业人员代表走上舞台集中宣誓，表达扫黑除恶专项斗争战之必胜的信心和决心。

1.3.2 ProEM-bPAG16 重组载体的构建参照课题组前期报道的酶切方法[17]，将表达载体ProEM 用EcoRI和HindIII 在37 ℃水浴中酶切1 h。酶切体系为：EcoRI 2.5 μL（10 U·μL−1），HindIII 2.5 μL（10 U·μL−1），ProEM 载体5 μL，10× FD Buffer 5 μL，ddH2O 加至50 μL。将酶切产物与目的基因在22 ℃下连接2 h，连接体系：4 μL 目的DNA 片段，3.5 μL 线性proEM载体，1 μL T4 DNA 连接酶（5 U·μL−1），2 μL 10×T4 buffer，9.5 μL ddH2O。

重组蛋白经Ni-IDA 柱分离，咪唑溶液洗脱，各组分经SDS-PAGE 进行检测，结果如图6 所示，在500 mmol·L−1的咪唑洗脱溶液中获得分子质量约为48 kDa 的目的蛋白，纯化后的蛋白条带单一。经Gel-Pro Analyzer 灰度分析，重组蛋白bPAG16 纯度大于90%。BCA 法测定其含量为0.1 mg·mL−1。

在SDS-PAGE 检测基础上进行Western blotting分析，分析结果如图7 所示，在约48 kDa 处出现特异性杂交条带，进一步证明了bPAG16 重组蛋白成功表达。

2.1 bPAG16 基因优化与合成

运用condnW 软件分析了bPAG16 基因密码子偏好性（表1），采用同义密码子使用度（Relative synonymous codon usage, RSCU）反映密码子使用的偏好性，当某密码子的RSCU值＞1 时，则表明该密码子使用频率较高。从表1 可看出除去终止密码子，bPAG16 基因中有25 个密码子的RSCU＞1，其中 CTG、AGA、TCT、GCC 密码子 RSCU≥2，偏好性较强。为了使表达基因的同义密码子使用频率尽可能与宿主细胞相匹配，以提高其基因表达水平，本试验对bPAG16 基因进行了优化，将使用频率低的密码子进行替换，优化后的密码子基本为宿主细胞偏好密码子。优化前后的碱基序列和氨基酸序列见图1，优化后的序列全长为1 185 bp，蛋白编码区（CDS）长度为1 140 bp，编码 380 个氨基酸（AA）；优化前后核苷酸同源性为76.4%，氨基酸同源性100%。优化后bPAG16基因的密码子适用指数（CAI）由0.77 提高到0.96（图2），GC 含量由48%提高到58%（图3）。将优化后的bPAG16 基因进行PCR 扩增，PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因片段大小与理论值相符（图4）。

2.2 重组质粒ProEM-bPAG16 的鉴定

阳性克隆PCR 鉴定结果见图5-A，目的条带与预期值大小相同。重组质粒双酶切鉴定结果见图5-B，泳道1 为未酶切的重组质粒，从上至下分别为重组质粒的环状、线性和超螺旋3 种状态，泳道2 为EcoRI 和HindIII 双酶切后的重组质粒，上端片段为ProEM 载体，片段长度为4 369 bp，下端片段为优化的bPAG16 基因，片段大小为1 179 bp，与理论值一致，表明重组载体构建成功。阳性克隆的测序结果与优化基因bPAG16 的碱基序列完全一致，其编码的氨基酸与GenBank 公布的完全一致（protein ID：NP_788790.1）。结果表明优化的基因序列正确插入表达载体中，未发生碱基突变。

表 1 bPAG16 基因密码子偏好性分析Table 1 Codon usage of bPAG16 gene in Ampullaria crossean

2.3 重组蛋白的表达及纯化

1.3.4 重组bPAG16 蛋白的表达及纯化参照本团队前期报道的方法[16,17]，将HEK293 细胞在37 ℃下进行复苏，转移至10 mL 培养基中，800 r·min−1离心5 min，弃上清，加入新鲜培养基重悬HEK293 细胞，使其密度为3～4×105cells·mL−1。然后将培养瓶置于培养箱中，在110 r·min−1、37 ℃、5% CO2条件下培养，当接种密度达到1×106cells·mL−1，加入转染级重组质粒和转染试剂，在110 r·min−1、37 ℃、5% CO2条件下培养5～6 d。收集细胞培养物，12 500 r·min−1离心10 min，上清过0.22 μm 滤膜，然后于10 mmol·L−1PBS 中4 ℃下透析过夜。透析液纯化前，Ni-IDA 柱用10 mmol·L−1PBS 平衡，流速为1 mL·min−1，直至流出液在280 nm 处的紫外吸光值达到基线水平。透析液以同样的流速上柱，然后用10 mmol·L−1PBS 冲洗Ni-IDA 柱，最后用洗脱液（10 mmol·L−1PBS，包含50 mmol·L−1或500 mmol·L−1咪唑）进行梯度洗脱，流速为2 mL·min−1。上清液、流出液和洗脱液进行SDS-PAGE 电泳，然后考马斯亮蓝染色并观察。BCA试剂盒测其蛋白浓度。

2.4 重组蛋白Western blot 鉴定

1.3.5 重组蛋白Western blot 鉴定将电泳分离后的重组蛋白采用半干式电转印法转至PVDF 膜上，膜经5%脱脂奶粉封闭和洗涤后，加入抗 His 标签小鼠单克隆抗体室温孵育1 h，之后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，孵育60 min。最后以ECL 发光试剂进行显影。

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3 讨论

bPAG 是家畜早期妊娠诊断的主要标志物，因此获取高纯度bPAG 蛋白是研发快速诊断产品的关键所在。由于传统的分离纯化技术很难获得高纯度的bPAG 天然蛋白，增加了对其结构和功能研究的难度，也限制了家畜早孕快速检测产品的研发。基因工程手段为获得大量高纯度的重组蛋白提供了思路。随着重组蛋白技术的发展，密码子优化成为提高外源基因在宿主内表达水平的一种有效手段。不同物种对同义密码子的使用频率不同，通过对基因的同义密码子进行优化使其与表达宿主的密码子偏好性相匹配，可提高蛋白的表达水平[18−19]。通常用密码子适应指数（CAI）来衡量基因的表达水平，CAI 值范围为0～1，越接近1 表示基因的达标水平越高[20]。本研究在不改变氨基酸序列的前提下，通过替代非偏好密码子及平衡GC 含量等策略优化了bPAG16 基因，优化后密码子CAI 大幅提高，同时减少了AT 和GC 富集区；然后通过全基因合成技术合成了bPAG16 基因，并将其插入到ProEM 载体中，成功实现了其在HEK293 细胞中的高效表达。进一步证明了基于全基因合成技术的密码子优化具有良好的时效性和实用性。

图 1 bPAG16 基因优化前后核苷酸、氨基酸对比结果Fig. 1 Nucleotide alignment of original and optimized bPAG16 genes

图 2 bPAG16 基因优化前后的密码子适用指数对比Fig. 2 CAIs of bPAG16 gene before and after codon optimization

图 3 bPAG16 基因优化前后的GC 含量对比Fig. 3 GC contents of bPAG16 gene before and after codon optimization

图 4 优化bPAG16 基因的PCR 扩增产物Fig. 4 Electropherogram of PCR products of codon-optimized bPAG16 gene

图 5 阳性克隆（A）及重组质粒双酶切（B）鉴定结果Fig. 5 Identification of cloning products (A) and recombinant plasmid (B)

图 6 SDS-PAGE 分析重组蛋白bPAG16Fig. 6 SDS-PAGE analysis on rbPAG16

图 7 重组蛋白bPAG16 的Western blot 鉴定Fig. 7 Western blotting analysis on rbPAG16

优化后bPAG16 基因CDS 长度为1 137 bp，编码379 个氨基酸残基，信号肽区域位于第1～15 位氨基酸残基，蛋白质理论分子质量为41.82 kDa。SDSPAGE 和Western blotting 分析结果显示，重组蛋白的分子质量约48 kDa，大于理论值，与Patel[11]和刘长彬等[16, 17]报道的结果相似。这与rbPAG 在表达过程中存在糖基化修饰有关，有研究表明bPAG 的氨基酸序列存在N-糖基化位点，导致其在翻译修饰后分子量增加[21]。本研究下一步拟采用制备的重组bPAG16为靶标，筛选特异性识别bPAG 的核酸适配体，代替抗体作为新型识别分子开发快速、简便的bPAG检测新方法，减低检测成本，使之更好地应用于奶牛早期妊娠诊断。