芦笋种质资源与育种技术研究进展

刘奇颀，瞿华香，余格辉，喻白鹏，张岳平

（1岳阳市农业科学研究院，湖南 岳阳 414000；2湖南农业大学，长沙 410000；3岳阳市农业综合行政执法支队，湖南 岳阳 414000）

0 引言

芦笋(Asparagus officinalis)又名石刁柏，是天冬门科天冬门属一种多年生草本植物，药食兼用，营养丰富，具有较好的抗肿瘤、抗氧化等功效。近年来，国内芦笋产业发展较快，种植面积约1×105hm2，居世界第一[1]。随着国内芦笋产业的发展，对芦笋种质资源和育种技术的研究也在逐步深入。近年来，国内科学家聚焦于芦笋资源创新利用研究，已培育出了一批高产优质的国产芦笋品种[2-4]。然而，芦笋产业发展依然面临自主知识产权优良新品种相对不足、高抗茎枯病品种资源缺乏等产业实际问题，基于资源创新利用的芦笋育种技术创新对于国内蓬勃发展的芦笋产业仍然具有十分重要的现实意义。

1 芦笋种质资源及其特性

芦笋起源于欧亚大陆及北非河谷及草原地带，国内早期芦笋相关种质资源主要依赖于国外引进，早期引进的品种主要来源于美国，包括‘Mary Washington’、‘Apollo’、‘Grande’、‘Atlas’、‘UC’系列等，并广泛在浙江、山东、辽宁、福建等省开展试种。随着国内外市场需求、种植环境等的变化，又不断引进欧洲等地芦笋品种资源，主要包括德国品种‘西德全雄’，荷兰品种‘Frankllim’、‘Gynlim’、‘Boolim’、‘Thielilm’、‘Gijnlim’，西班牙品种‘Damas’，以及新西兰品种‘JWC1’、‘Taramea’等[5-10]。国内各地广泛分布着各类数量丰富的芦笋近缘野生种质资源，这对于开展资源创新利用、拓宽芦笋的遗传背景具有重要意义。

近年来，国内学者对于国内外不同来源的芦笋种质资源特性开展了相关研究，这为进一步了解不同资源农艺性状并开展综合利用提供了理论基础。陈河龙等[11]认为，芦笋种质资源的最主要农艺性状为株高和茎粗，且芦笋产量与株高密切相关。他对40份芦笋种质资源的茎粗、株高及其相关性进行比较分析。结果表明，‘Pacific Purple’、‘Purple Passion’、‘UC157’、‘冠军’、‘JK107’5个品种在株高和茎粗上表现较好，其中后3个品种的产量也相应较高，但是‘Pacific Purple’和‘Purple Passion’产量并不是太高，可能是由于紫色芦笋分支相对较少，导致总产量表现不佳，茎粗和株高相关性研究结果显示大部分品种的株高和茎粗的相关性不大[11]。为筛选出营养物质含量丰富的种质资源，陈河龙等[1]对46份国内外不同芦笋种质资源的营养品质进行了综合评价，初步筛选到‘Pacific Purple’、‘JK106’、‘Backlim’、‘Gijnlim’等资源。王培等[12]分析发现，不同种质资源之间株高和茎秆数差异较大，大部分种植株高集中在60～85 cm，茎秆数集中在5.75～8.25根；其中有2个紫色芦笋资源茎秆数相对较少，与前文中陈河龙等[11]的研究结果一致，大多数种质资源的株高和茎秆数之间没有显著相关性。

研究发现，芦笋生态适应性较强，在国内许多地区都适宜种植，但不同品种资源在不同气候条件下的产量和品质有较大差异，即使是同一资源品种在不同生态条件下，其农艺性状、丰产性和品质表现都有较大差异[13]。王连平等[7]对从国外引进的9个芦笋品种在浙江主产区适应性进行试验，对其抗病性、产量及商品品质等性状作综合评价。结果表明，‘Imperial F1’、‘Grande F1’、‘Apollo F1’和‘Atlas F1’等品种生长势旺盛，品质优、产量潜力较大，并且夏季笋较少，春季和秋季笋较多，单位面积经济价值高，在浙江的推广应用价值大。陈振东等[14]为筛选适应福建生态区的优良新品种资源用以示范推广，对不同资源在福建省的主要经济性状、产量、抗性表现进行了初步研究，结果表明，‘UC142’、‘Thielim’、‘Gijnlim’3个品种的产量、嫩茎粗度和抗病性都比本地主栽品种高，初步认为可作为新一代品种进行推广。曹岩坡等[15]研究表明，在华北地区‘NJ951’和‘NJ857’表现出产量高、抗病性强及商品品质表现优良的特性，适宜在中国华北地区推广种植。李改珍等[16]研究表明，‘Apollo’、‘Atlas’、‘京绿芦1号’、‘冠军’、‘Mill’、‘NJ1123’等资源在山西生态区种植产量、抗病性及商品品质等性状上表现较好，推广应用价值较大。邹金环等[17]多年资源比较试验表明，‘特拉华2号’、‘特拉华4号’抗盐性、抗病性、品质及产量等方面表现良好，适于黄河三角洲地区栽培。李彩华等[18]连续3年对引进的15个芦笋资源进行研究，结果表明‘Pacific2000’、‘Grande F1’、‘京绿1103’、‘096’4个品种在生育指数、干重、鲜重、抗盐性等方面表现良好，适合黑龙江省盐碱地区生长，而‘Jersey Knight’、‘Apollo F1’、‘NJ977’、‘1034’对盐碱地反应较为敏感，不适合盐碱地种植。

2 芦笋主要育种技术

2.1 选择育种

从现有的种质资源群体中，选出可供利用的优良的自然变异个体，用来培养优良新品种或新品系，这是芦笋原始栽培种大多采用的选育方法。据王秀等[19]报道，由台湾台南区农业改良场从‘UC711’中选育出的‘台南选3号’形态良好，笋尖紧，嫩茎较‘UC711’粗大，产量比‘UC711’高15%～20%，对立枯病、根腐病抗性较强，对茎枯病及褐斑病耐力中等。马光灼等[20]从‘Mary Washington’群体中选取性状相对一致的优良雌雄株，经过多代选育，获得遗传性状稳定的芦笋品系，定名为‘黔园9号’，对其营养成分的研究表明，营养品质优于‘Mary Washington’。张津来等[21]以‘Mary Washington 500W’为材料，经试管苗茎段离体培养，选育出优良品系‘金岭85’，该品系表现出笋粗、笋多、早发、丰产等特性。

2.2 杂交育种

芦笋雌雄异株，长期异交，这为芦笋新品种选育提供了丰富的基因资源。同时，芦笋为多年生草本，基因型高度杂合，品种选育周期长，为提高杂交育种效率，通常结合组培快繁技术，扩繁2个亲本的单株无性系，利用雌、雄亲本无性系进行规模制种，繁育新品种（系）。张元国等[22]从不同资源试验田筛选出综合性状优良的变异单株43株，利用有性杂交组配58个组合，1989年选育出了国内综合性状突出的早期芦笋新品系‘88-5’，通过品比试验发现，‘88-5’较山东主栽品种‘Mary Washington 500W’增产15.6%，一级笋率提高9.6%，空心率降低6.2%，抗茎枯病能力较对照提高45%。1996—1999年李书华等[23-25]采用来自‘荷兰全雄’中的全雄株系与来自无性F1代杂种‘Apollo’中的优良雌株杂交选育出‘冠军’；采用来自‘西德全雄’中的优良单株与来自无性F1代杂种‘Grande’中的优良雌株选育出‘新世纪’；随后通过杂交选育方法选育芦笋新品种‘芦笋王子’。缪美华[26]通过筛选优良杂交组合，结合组培快繁技术，于1997年育成了高产、抗病的芦笋新品系‘96-1’，该品系母本是从‘UC800’中选出的优良单株，父本是从‘泽西巨大’中选出的优良单株。张立宾等[27-28]从耐盐资源中筛选出品质优良、耐盐性强的芦笋雌雄单株，利用杂交选育方法选育出耐盐新品系‘盐笋1号’，2003年通过东营市科技局成果鉴定。陈光宇等[29]以‘台南3号’优良雄性单株为母本，以荷兰品种‘Backlim’优良雄性单株为父本，通过杂交选育了无性系杂交F1优良绿芦笋新品种‘井冈701’。叶劲松[30]利用来源于美国血统的母本和来源于荷兰血统的父本杂交选育出‘京绿芦1号’。近年来，传统的杂交选育在芦笋新品种改良种具有广泛的应用，先后取得了一些成功的实例[31-34]，为培育具有自主知识产权的芦笋新品种提供重要的技术方法。

2.3 多倍体育种

芦笋一般为二倍体，多倍体芦笋往往表现出植株高大、出笋粗壮、生物量大、抗性较强、营养较丰富等特征，芦笋多倍体育种具有较大的现实意义[35-37]。潍坊市农科院在国内首次利用多倍体育种技术，以‘UC800’经秋水仙碱染色体加倍诱导出的优良四倍体单株做父本，‘Mary Washington 500W’的优良二倍体单株做母本，杂交选育出三倍体芦笋品系‘J2-2’[35]。江西省农科院从芦笋试验材料中选择产量高、品质优良的雌雄单株进行自交，连续自交后代经组培繁殖优良单株于2002年开始进行配组杂交，培育出以四倍体紫芦笋‘Purple Passion’的优良株系为母本、以四倍体紫芦笋‘Pacific Purple’的优良株系为父本的四倍体紫芦笋新品种‘井冈红’[37]。

除多倍体选育，前人更多地对芦笋多倍体诱导条件进行研究。秋水仙素是应用最为广泛的人工诱导多倍体的化学诱变剂，于继庆等[38]研究了秋水仙碱、8-羟基喹啉、对-二甲苯、富民农4种药剂对芦笋染色体加倍效果，结果表明秋水仙碱对芦笋多倍体的诱变效果也是最佳。秋水仙碱的处理浓度和处理时间显著影响芦笋多倍体诱导效果。邹道谦等[39]用0.2%秋水仙素溶液分别处理芦笋萌芽种子24、48 h，均获得了四倍体，处理48 h诱变率更高，可达36.8%。陈春桦[40]在不同因子对‘井冈701’二倍体芦笋诱导效果的研究中也得出了相同的结论。郑思乡等[41]发现，以浓度为0.1%的秋水仙素溶液浸泡芦笋试管苗12 h，加倍效果最佳，加倍率6%。这2个研究的加倍率显著低于前人的研究，可能是由于处理时间较短。影响多倍体诱导效果的另一个重要因素是处理方法的选取。韩成云等[42]以秋水仙碱为诱变剂，分别用浸泡法和涂抹法对芦笋试管苗进行多倍体诱导，结果表明，无论是从形态学还是染色体数目比较，均以涂抹法染色体加倍效果较佳，0.10%秋水仙素涂抹72 h的加倍率可达94%。张天翔等[43]分别用浸泡法和培养基添加法进行多倍体诱导，发现在培养基中添加0.3%秋水仙碱并处理7天，染色体加倍率和成活率可达82.5%和80%。值得一提的是，在对芦笋多倍体诱导的研究中发现，芦笋多倍体诱导过程中出现了植株加倍倍数不一的现象，能观察到四倍体植株和八倍体植株，同时存在大量嵌合体[40-42]。虽然四倍体植株较二倍体植株粗壮、抗性更强、营养成分更高，但是也同时存在四倍体植株单株结实率显著减少的现象[38]，并且芦笋四倍体芽的分化与生长很容易，而根的分化相对困难，初步研究显示，NAA、IAA与IBA对根的分化、生长有促进作用，2,4-D没有作用，6-BA极不利于生根[41]。

2.4 全雄育种

当前，全雄育种已成为芦笋育种的重要突破口之一。前人研究表明，芦笋的雌雄性别是由一对等位基因控制的，雄性植株基因型为Mm，雌性植株基因型为mm，还有一种超雄植株的基因型表现为MM。因此，生产上可利用芦笋超雄株与雌株杂交开展全雄育种，即F1代植株全部表现为雄株[44-49]。目前，生产上获得芦笋超雄株的主要有2种方法[47]，一是雄性两性株自交，在自交后代中筛选超雄株；二是花粉培养诱导芦笋雄核形成双单倍体单株。

2.4.1 雄性两性株自交 在自然条件下，芦笋会极少地表现出雄性系中两性花同株现象，这种情况非常罕见，但极有意义。两性株的基因型为Mm，但却可以表现出自交结实，自交可产生25%的超雄株(MM)后代，利用超雄株与优良的雌株开展杂交选育，就可以培育芦笋优良全雄新品种。栾法芳等[48]通过利用两性株自交，4年间得到28粒种子，最后筛选出1株超雄株。张岳平等[44]报道江西省农科院通过利用两性株自交后代筛选优良超雄株，然后通过杂交选育方法培育出国内首个芦笋无性系全雄优良新品种‘井冈111’。潍坊市农科院以优良超雄株与优良雌株组配杂交组合，选育出了以‘NX10-1’为母本、‘sy20-3’为父本的全雄品种‘WF-8’[50-51]。杨海峰等[52]以雄性两性株自交S1代超雄株为父本，以‘993A’优良雌株为母本，杂交组配筛选出综合性状较好的后代组合‘X0812’，具有极强的杂种全雄优势。

2.4.2 花药培养 开展芦笋花药培养的第一步是外植体取材，花粉发育时期是影响结果的关键因素之一。一般来说，处于单核中期或晚期的小孢子活跃度高，是不同分裂方式和发育途径的共同起点，培养效果好，通过确定芦笋花器的外部形态特征与小孢子发育时期的对应关系，可以更加便捷地从外观形态（通常是花药长度）直观地判断花粉发育时期[53]。前人研究发现，处于花粉四分子期—单核期的花药最易形成愈伤组织[54-55]。陈海媛等[56]以‘Apollo’F1代为试材，结果表明1～2 mm的花蕾愈伤组织诱导效果最佳。前人分析不同倍性芦笋的花粉诱导效果，二倍体最佳诱导花蕾长度为1.5～2.0 mm，四倍体最佳诱导花蕾长度为2.0～2.5 mm[57-59]。试材的生理状态（包括所处的温度、光照条件及营养状况等）也对花药培养有一定影响，研究表明，露地栽培的芦笋材料愈伤组织诱导率高于温室栽培材料，且接种时间以4月底为最佳[57,59-60]。低温能够改变小孢子的分裂方式，启动雄核发育，并且对于芦笋花药培养来说，低温处理的体细胞愈伤组织形成率也较低[61]。范双喜等[54]研究认为4℃下处理3～5天较为适合芦笋愈伤组织形成，后人研究中也多采用该处理方式[56,60,62-63]。芦笋花药愈伤组织诱导的其他重要条件还包括培养基中添加的激素种类、用量和配比。沈光华等[64]研究表明当NAA与6-BA之比为1:1时，既有利于芽的分化又有利于根的分化。研究认为，细胞分裂素对芦笋花药形成愈伤组织有重要作用，6-BA的影响大于NAA，最佳条件为MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA(6-BA:NAA=2:1)[55-56,60]。亦有研究发现，2,4-D浓度为0.5～1.0 mg/L能有效提高愈伤组织诱导率，但当其浓度过高时畸形现象较多[57-58,65]。蔗糖对小孢子的脱分化和再分化也起到有利作用[58,60-61]。不同芦笋品种的花药培养效果差异明显，不同基因型对芦笋花药培养具有重要影响。品种间差异主要是由品种的遗传差异引起的，其中也包括基因对培养基成分的适应性和选择性[64-66]。芦笋花药愈伤组织诱导率不仅在品种间差异很大，即使同一品种的不同植株诱导率差异也非常显著[58,60,67-68]。

2.4.3 小孢子培养 芦笋花药培养的一个重要缺陷在于再生植株形成单倍体的频率比较低，非常容易受到体细胞的干扰，而采用小孢子培养能较好地避免这个问题。Zhang等[69]研究报道，芦笋游离小孢子在1.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BA的液体MS培养基中，可以获得小孢子胚和愈伤组织，将愈伤组织转瓶至固体MS培养基中，添加激素2,4-D 1.0 mg/L和BA 0.2 mg/L，6周后可获得单倍体再生植株。汤泳萍等[70]研究发现，当花药颜色为黄或黄绿，花蕾长度在2.0～2.4 mm时，大部分小孢子处于单核靠边期，可作为芦笋小孢子培养的最佳时期；变温处理相较高温处理更有利于小孢子膨大，促进小孢子的雄核发育机制；不同的基因型之间小孢子愈伤组织诱导率差异显著；小孢子培养的适宜培养基为改良MS、0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 2,4-D、400 mg/L葡萄糖和6%的蔗糖。蔡坤秀等[71]以25个基因型的芦笋为试材，发现影响成功诱导愈伤组织的一个关键因素是供体基因型，不同基因型差异显著。

2.5 分子标记辅助育种

获得超雄株是全雄育种广大前提，除培育超雄株外，超雄株的筛选也是实现芦笋全雄育种的关键。芦笋属于多年生草本植物，生长周期较长，一般而言，从播种到开花的周期约为2年，超雄株与一般雄株在植株生理和开花特性表型上都无明显区别。因此，通过利用与性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记进行辅助育种，可提高育种效率，实现在苗期准确高效鉴定芦笋性别基因，高效筛选芦笋超雄株。卢龙斗等[72]研究发现雌性芦笋能够扩增出一条相当于RAPD标记的特异带，而在雄株中则不能扩增出该特异条带，说明该克隆包含有与雌性相连锁的特异性片段。韩莹琰等[73]通过BSA法构建了芦笋雌雄基因池，筛选出了一个与M基因连锁的AFLP标记。李书华等[74]通过AFLP标记分析，从芦笋雄性植株基因组中成功扩增出一个雄性连锁的AFLP标记MLDA555，并将该标记转换成稳定且容易操作的SCAR标记。周劲松等[75]利用与芦笋性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记Asp1-T7和Asp1-T7sp对测交父、母本进行多态性分析，发现这2个分子标记在目标测交组合父母本间有多态性，随后利用Asp1-T7对测交组合单株进行检测筛选出全雄组合，并用Asp1-T7sp对筛选出的全雄组合进行扩大检测验证，筛选结果与田间调查实际表型结果基本吻合，说明利用现行DNA分子标记结合测交筛选芦笋超雄株的方法在理论和实践上均可行有效。

3 展望

芦笋种植经济效益好，营养丰富，富含各种活性成分，符合大健康农业发展方向，其产业发展前景广阔，面临较好的产业发展机遇也面临一些重点技术挑战。现有芦笋商业品种遗传背景相对狭窄，种质资源的遗产多样性偏低，限制了更多的芦笋优质、高抗、高活性成分优良新品种的选育。在现有芦笋商业品种的抗病性鉴定中基本未见有高抗病性品种的报道，引种的主要来源欧美等国，气候冷凉干燥，芦笋茎枯病发生较轻，因此这些品种在芦笋茎枯病抗性方面不突出，而国内大部分芦笋产区茎枯病的病发率都较高，病害防治成本高、耗工大。虽然花药培养研究有较多报道，也获得了单倍体、双倍体植株，但成功用于全雄育种的并不多。当前芦笋重要功能基因挖掘与标记开发，主要集中于芦笋性别，其他目标性状研究几乎未见报道，芦笋分子标记前景选择仅局限于雌雄性别。

鉴于此，笔者认为今后芦笋种质资源创新和育种技术研究工作可重点从2个方面寻求突破。（1）高度重视芦笋种质资源的创新利用，尤其是来源于国内本土的不同近缘野生种质资源，更大程度地拓宽现有芦笋资源的遗传背景，为适应不同生态区的优良新品种选育提供材料基础。特别需要切实加强芦笋茎枯病抗性资源的创新利用，选育一系列高抗茎枯病品种，从品种上彻底解决茎枯病这一芦笋产业发展的重要技术瓶颈。（2）基于传统技术手段和芦笋生物学特性的育种技术创新，开展多元化育种，高效推进优质、高抗、高活性成分优良新品种选育。结合芦笋基因组信息平台，开发与芦笋优异性状紧密连锁的分子标记，持续推进芦笋全雄育种，芦笋花药和小孢子培养重点应进一步加强，解决体细胞干扰等，建立一套行之有效的培养技术体系，与芦笋全雄品种培育紧密结合。