不同生长阶段灵芝子实体和孢子粉活性成分分析

李钦艳，钟莹莹，李 忠，肖自添，古培总，何焕清，钟小云，彭洋洋

（1梅州市农林科学院微生物研究所，广东 梅州 514071；2广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省草菇科技创新中心/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640）

0 引言

灵芝(Ganoderma lingzhi)为担子菌纲多孔菌科灵芝属食药用菌，是中国传统的中药材[1]，并于2019年11月25日被国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局认定为医食同源物质，深受消费者喜爱。灵芝化学成分复杂，含有多种活性物质，如多糖、三萜类、甾醇、腺苷、氨基酸、脂肪类等[2]。其中，多糖和三萜类化合物是灵芝的主要活性成分，是孢子粉和灵芝子实体的重要生物活性物质，其含量可作为衡量灵芝质量的标准[3]，多糖的生物活性适用于提高免疫力、抗肿瘤和抗衰老[4]，三萜类的生物活性适用于抗炎、保肝护肝[5-6]。蛋白质是灵芝除灵芝多糖和三萜外的又一重要活性物质，具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]等作用[10]，灵芝中的真菌免疫调节蛋白质(fungai immunomodulatory protein，FIP)Ling Zhi-8有促进淋巴细胞增殖、抗炎、抗过敏、抗排斥、抗肿瘤、调节血糖等作用[11]。灵芝中有近20种甾醇类，其骨架分为麦角甾醇类和胆甾醇类2种类型，灵芝胆甾醇类化合物有神经保护作用[11]。腺苷也是灵芝主要活性成分之一，属于核苷类化合物，具有抑制体内血小板聚集，提高血红蛋白含量，加速血液循环，有效降低血液粘稠度，对心血管系统有广泛的调节作用[12]。灵芝的脂肪类物质同样具有重要的生理功能，主要物质脂肪酸能提供能量、参与细胞膜组织结构等，还具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒等功效，特别是不饱和脂肪酸，在抗肿瘤、降低心脑血管疾病、延缓免疫功能衰退等方面有重要作用[13-14]。灵芝子实体生长经历菌蕾期、菌柄分化期、子实体分化期、子实体成熟期、孢子成熟期、孢子收获后期等阶段，其活性成分含量会因不同生长阶段、栽培环境、品种、栽培配方、培养方式、采收时间等而变化[6,14-18]。研究不同生长发育阶段灵芝子实体与孢子粉活性成分含量的相关性，探索灵芝及孢子粉的最佳采收时期，对实际生产和消费指导具有十分重要的意义。

前人的研究大多集中在不同生长阶段灵芝子实体多糖、三萜类化合物的含量、组成等变化，或者单纯比较灵芝子实体与孢子粉的差异等，未见根据实际生产情况，对灵芝子实体与孢子粉采收时间进行综合分析，未见报道不同收集时期孢子粉的活性成分含量分析。

本研究以梅州本地主栽品种‘梅灵1号’灵芝为研究材料，结合当地栽培习惯和栽培方法对不同阶段灵芝子实体和孢子粉活性成分进行研究。旨在通过分析灵芝不同生长阶段子实体及不同收粉时期孢子粉的活性成分，为灵芝子实体和孢子粉最佳采收期的确定提供理论依据，也为消费者选择相关灵芝产品提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

‘梅灵1号’（梅州本地品种）灵芝菌株来源于梅州市农林科学院微生物研究所菌种保藏中心。试验于2019年6—10月在梅州市农林科学院微生物研究所灵芝示范基地进行，灵芝子实体和孢子粉由该基地栽培采收获得。孢子粉经专用破壁机低温破壁处理。

1.2 试验材料

杂木屑、干玉米粒、马铃薯、麸皮、玉米粉、石灰、石膏等均购自当地经销商。栽培原料符合《食用菌栽培基质安全技术要求(NY 5099—2002)》，不使用任何添加剂和杀菌、杀虫剂等。

1.3 试验配方

1.3.1 母种配方 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.3.2 原种培养基配方 干玉米粒（不粉碎）99%、石膏1%，含水量约60%，pH 8。

1.3.3 栽培种及栽培菌包配方 杂木屑78%、玉米粉6%、麸皮15%、石膏粉1%，含水量约60%，pH 8。

1.4 栽培方法

1.4.1 子实体培养 采用常规灵芝室内代料栽培方法，具体操作参照文献[19]。原材料混匀后调整含水量至60%，试验选用规格为17 cm×35 cm、厚5 mm的聚丙烯塑料袋，每袋装培养料（干重计）350 g，装好后用常压灭菌方式灭菌，保持100℃下恒温16～18 h。灭菌后冷却至室温接种，接种时严格按无菌操作规程进行。接种后将菌包搬入培养室进行墙式排放，自然温度条件下培养发菌，室内保持黑暗，早上、中午、晚上各通风1 h，培养过程中发现受污染的菌包及时清理出培养室，菌丝满菌袋时间约为45天。待菌丝长满菌包进行出芝管理。用小刀在菌袋的扎口上方开一个十字形的小口，灵芝子实体将由十字形小口长出。开好口后将菌袋均匀摆放到出菇房，温度22～28℃，空气相对湿度85%～95%，出菇房经常通风换气，保持新鲜的氧气供应。

1.4.2 孢子粉收集 试验菌袋上长出的灵芝子实体边沿的金黄色转为棕红色时，将菌包清洗干净，选择长势相当的灵芝同时上架（灵芝孢子粉收集培养架采用杉木制作，多层式培养架规格为长×宽×高=2 m×1 m×2 m，分3层，层间距为60 cm）。上架完毕后用白纸进行密封，采用常规方法进行产粉管理，温度22～28℃，空气相对湿度85%～95%，经常通风换气，保持新鲜的氧气供应。

1.5 样品采集

1.5.1 灵芝子实体采集 共采集4个不同生长阶段的灵芝子实体。（1）菌蕾期子实体，刚刚长出菌袋切口的幼嫩灵芝（图1a）；（2）成熟期子实体，子实体边沿的金黄色转为棕红色时，刚刚成熟但未弹粉的子实体（图1b）；（3）弹粉期子实体，上架20天收集孢子粉（头道孢子粉）后的子实体（图1c）；（4）弹粉后期子实体，上架40天，即头道孢子粉收集后重新上架培养20天，再收集孢子粉（二道孢子粉）后的子实体（图1c）。

1.5.2 灵芝孢子粉采集 按照梅州本地的常规灵芝孢子粉收粉方法，有一次收集法和二次收集法2种。一次收集法是把灵芝放入收集架里，持续等到孢子粉弹射完毕后一次性收集孢子粉。二次收集法是孢子粉弹射一定时间收集孢子粉后，将灵芝重新放回收集架，再培养，再收集。本试验设计的上架弹粉阶段共计40天，共采集3种灵芝孢子粉样品。（1）上架弹粉20天即开架收集孢子粉，此阶段收集的孢子粉称为头道孢子粉；（2）头道孢子粉收集后重新上架密封，继续弹粉20天，开架收集孢子粉，此阶段收集的孢子粉称为二道孢子粉；（3）产孢40天孢子粉，收集上架密封后持续弹粉40天的孢子粉。所有灵芝孢子粉样品都经相同条件破壁后再进行营养成分检测。

图1 灵芝子实体

1.6 营养成分检测

成分分析委托中国广州分析测试中心完成。灵芝多糖、三萜及甾醇类化合物测定方法参照《中国药典（2015年版一部）》灵芝项下；腺苷测定方法参照NY/T 2116—2012；蛋白质测定方法参照GB 5009.5—2016第一法；脂肪测定方法参照GB 5009.6—2016第一法。

2 结果与分析

2.1 不同样品多糖含量比较

从图2可以看出，不同生长阶段灵芝子实体的多糖含量呈下降趋势，菌蕾期含量最高，为0.65%，成熟期子实体多糖下降为0.43%，弹粉后子实体多糖含量趋于稳定，但显著低于菌蕾期和成熟期，分别为0.28%、0.27%。孢子粉二次收集法比一次收集法多糖含量高，其中二道孢子粉多糖含量最高，达0.85%，其次是头道孢子粉，分别比40天一次性收集的孢子粉多糖含量提高21.43%和18.57%，表明采用二次收集法的孢子粉多糖含量更高，但头道孢子粉与二道孢子粉多糖含量没有显著差异。此外，孢子粉多糖含量高于子实体，其中二道孢子粉多糖含量比弹粉后期上架40天子实体高2倍以上。

图2 不同样品多糖含量比较

图3 不同样品三萜及甾醇含量比较

2.2 不同样品三萜及甾醇含量比较

从图3可以看出，灵芝子实体的三萜及甾醇含量比较稳定，不同阶段间没有显著差异，菌蕾期含量为2.2 g/100 g，其余时期含量均为1.9 g/100 g。不同阶段的破壁孢子粉三萜及甾醇含量差别也不大，为12～14 g/100 g，上架收集40天的破壁孢子粉含量最高，达14 g/100 g，其次为二道孢子粉，一次收集法三萜及甾醇含量高于二次收集法。孢子粉三萜及甾醇含量远高于灵芝子实体，约为灵芝子实体的6～12倍。

2.3 不同样品腺苷含量比较

从图4可以看出，不同生长阶段灵芝子实体的腺苷含量差异很大，菌蕾期和成熟期的子实体腺苷含量低于检测下限（检测下限为10 mg/kg），弹粉后开始增加，弹粉期为86.5 mg/kg，弹粉后期为99.2 mg/kg。破壁孢子粉腺苷含量显著高于子实体，其中二道孢子粉的腺苷含量最高(214 mg/kg)，二次法收集的孢子粉腺苷含量高于一次法收集的。

2.4 不同样品蛋白质含量比较

从图5可知，不同生长阶段灵芝子实体的蛋白质含量差异较大，随着子实体的生长呈下降趋势。幼嫩、未成熟的子实体蛋白质含量高，弹射孢子粉后含量下降明显。菌蕾期蛋白质含量最高(25.5 g/100 g)，弹粉后期降到最低(8.14 g/100 g)，弹粉后子实体蛋白质含量没有显著差异，趋于稳定。不同采收期的孢子粉蛋白质含量比较稳定，分别为16.3、16.1、16.6 g/100 g，没有显著差异，孢子粉蛋白质含量高于成熟期的子实体含量。

图4 不同样品腺苷含量比较

2.5 脂肪含量分析

从图6可知，不同生长阶段灵芝子实体的脂肪含量较低，且差异不大。不同采收期的破壁孢子粉脂肪含量高且较稳定，不同采收期没有显著差异，头道孢子粉含量最高(34.2 g/100 g)，二次收集法脂肪含量高于一次收集法。孢子粉脂肪含量极显著高于子实体含量，约为子实体的9～13倍。

3 结论

菌蕾期子实体活性成分含量高，多糖、三萜及甾醇、蛋白质、脂肪含量分别为0.65%、2.2 g/100 g、25 g/100 g、3.1 g/100 g，高于其他时期子实体活性成分含量，生产中多余的菌蕾往往被修剪下来，这些菌蕾可以食用或者作为活性成分提取原材料。

子实体多糖、蛋白质含量随着子实体生长而逐渐降低，三萜及甾醇、脂肪含量比较稳定，没有显著变化，腺苷随着子实体生长而增加，在未成熟的灵芝子实体中未检出。若不收集孢子粉，灵芝采收时间可适当提前至成熟期（孢子粉未弹射），即子实体刚刚成熟时，此时各种活性成分含量较高。

不同阶段破壁孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪含量均高于灵芝子实体，其中三萜及甾醇含量约为子实体的6～12倍，脂肪为9～13倍。

头道孢子粉、二道孢子粉、上架收集40天孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪、蛋白质等活性成分无明显差异，粉碎了灵芝孢子粉市场上关于头道孢子粉营养价值更高的谣传。

4 讨论

图5 不同样品蛋白质含量比较

灵芝子实体不同生长阶段活性成分的含量和变化一直是人们关注的问题，其受生长阶段、栽培环境、品种、栽培配方、培养方式、采收时间等因素影响而变化[6,14-18]，目前并没有统一的规律或者标准来评价灵芝产品质量。笔者首次比较完整地研究了灵芝子实体不同生长阶段以及孢子粉不同收粉阶段主要活性成分的含量和变化规律。试验结果表明：（1）子实体多糖含量随着子实体生长而降低，菌蕾期最高，弹粉后趋于稳定，此结果与李保明[20]、林应兴[21]等研究结果相似，推测子实体成熟后大部分多糖转移到孢子粉中。试验结果也显示，孢子粉多糖含量明显高于子实体。陈军辉[22]、于华峥[23]等对灵芝子实体、菌丝体及孢子粉中多糖成分差异比较研究也表明，灵芝孢子粉多糖含量高于子实体，与本研究结果一致。（2）子实体不同生长阶段三萜含量比较稳定，各生长阶段间差异不大，菌蕾期最高。而徐新然等[24]指出，灵芝木段栽培法的总三萜酸含量在灵芝现蕾期、菌盖形成期变化不明显，弹孢子粉前期最高（与现蕾期、菌盖形成期差异不显著），在弹孢子粉后期显著降低，此结果与本试验有一定差异，推测与灵芝品种、栽培方法、栽培环境等因素有关。本试验中孢子粉的三萜与甾醇含量极显著高于子实体。谭洪升等[25]采用高氯酸显色法测定灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量，证实破壁灵芝孢子粉中的三萜质量分数明显高于灵芝子实体，与本研究结果一致；于华峥等[26]通过高效液相色谱检测灵芝菌丝体、子实体、孢子粉（未破壁）的三萜含量，显示子实体的三萜种类多样且含量高，菌丝体中三萜主要为灵芝酸S且含量低，未破壁孢子粉中基本检测不到灵芝三萜，说明孢子粉破壁是三萜类物质释放的关键要素。（3）腺苷含量随着子实体生长而增加，在未成熟的灵芝子实体中未检出，孢子粉的腺苷含量显著高于子实体。于华峥等[26]研究了灵芝菌丝体、子实体、孢子粉（未破壁）的三萜含量，结果显示只在孢子粉中检测到灵芝腺苷。（4）蛋白质含量随着子实生长呈下降趋势，菌蕾期最高，孢子粉含量显著高于子实体，于华峥等[26]研究结果也显示，孢子粉蛋白质含量最高，其次是子实体，菌丝体含量最低。（5）子实体脂肪含量较低，孢子粉的脂肪含量高，为子实体的10倍以上，占灵芝脂肪总量的90%左右，子实体间不同阶段、孢子粉间不同阶段均无显著差异。孟楠楠等[27]对6个灵芝子实体及破壁孢子粉粗脂肪等营养成分进行比较，结果显示破壁孢子粉粗脂肪含量约为子实体粗脂肪含量的10倍，子实体间不同处理、孢子粉间不同处理均无显著差异，与本试验结果一致。

图6 不同样品脂肪含量比较

菌蕾期多糖、三萜类、蛋白质、脂肪等活性成分含量较高，生产中修剪下来的菌蕾可以进一步加工利用。课题组将进一步对不同生长阶段灵芝子实体、孢子粉的活性成分进行深入研究。本试验的初步结论为开发灵芝产品提供了更有针对性、更有效、更合理的参考，对实际生产和理性消费具有一定的指导作用。