马铃薯致病疫霉拮抗细菌研究进展

高梦颖，付海燕,4，孙 丛，王颜波，刘春光，马玉堃，杨峰山

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，哈尔滨 150080；3黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080；4东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心 150040）

0 引言

马铃薯致病疫霉是马铃薯种植生产中最重要的病害之一，曾经给马铃薯种植业造成了毁灭性的危害[1]。1845年爱尔兰因马铃薯致病疫霉导致马铃薯绝产，造成了100万人死亡，马铃薯致病疫霉的防控成为了科学家和种植者的一个挑战[2-3]。传统对马铃薯致病疫霉的防治措施是以大量喷施化学杀菌剂为主[4]，而化学药物的滥用乱用易导致环境污染并产生药物残留，且随时间的推移，杀菌剂会在病原体中建立抗药性，使马铃薯致病疫霉极易产生抗药性和变异[5-6]。此外，杀菌剂对有益生物如固氮细菌、菌根真菌等产生不利影响[7]，对生态环境和人类健康造成不可逆的伤害，这与当今社会追求绿色环保的理念相违背。而且马铃薯致病疫霉在不同的生境条件会产生侵染力强，破坏性大的不同生理小种，使病菌基因型和小种组成便得更为复杂，进而导致现有得马铃薯品种丧失抗病性[8]。寻找环境友好型管理方式已迫在眉睫，田间管理、培养良种、生物防治相继被提上日程，然而各地气候条件存在差异，导致不同地区马铃薯致病疫霉的发病规律不同，使得田间管理在实施过程中存在很多不足，难以形成统一定论。而马铃薯致病疫霉会产生侵染力强，破坏性大的生理小种，使病菌基因型和小种组成变得更为复杂，导致原有的马铃薯品种丧失抗病性，且培育良种又存在耗时长，研究进展慢的问题。

在此大背景下，寻找优良的马铃薯致病疫霉治理方法已成为当务之急。以合理预测预报预防、环境友好的生物防控技术为主的综合防控方法是目前马铃薯病害研究防控的主要方向，生物防治具有高效低毒、安全环保等众多优势，现已逐步成为植物病害防治的有效途径之一[9]。运用微生物拮抗菌进行生物防治，达到平衡病原菌致病性和致病力是目前国内外病害防治研究的热点领域，也是防治马铃薯致病疫霉生物农业研发的主要途径[10]。

查阅近年来相关文献时可以发现真菌、细菌、放线菌等均被发现具有拮抗马铃薯致病疫霉的能力，其中因细菌的种类繁多、繁殖快等特点更容易被发现和研究，在细菌类拮抗菌中以芽孢杆菌、假单胞菌和粘细菌为主。但是在对马铃薯致病疫霉拮抗菌的研究中以简单的拮抗菌筛选与鉴定为主，对拮抗菌抑菌活性物质、抑菌机理机制以及田间生产应用方面研究较少。本研究较为系统的介绍了国内外的马铃薯致病疫霉拮抗细菌的研究进展，分析归纳主要拮抗细菌的拮抗效果及拮抗物质，并指出拮抗菌领域存在的一些问题，以期对深入探索研究拮抗菌的抑菌能力贡献微薄之力。

1 马铃薯致病疫霉致病机制研究

1.1 马铃薯致病疫霉致病菌特性

马铃薯致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)de Bary)属于卵菌纲鞭毛菌亚门霜目疫霉科疫霉属真菌[11]。寄主种类少，仅侵染马铃薯、番茄及其他50个茄属植物。

目前世界已发现的马铃薯致病疫霉的交配型分为5种：A0交配型、A1交配型、A2交配型、A1、A2交配型和自育型[12]。马铃薯致病疫霉生活史同时包括无性和有性两个阶段，其中无性生殖阶段是维持遗传的稳定性和病原菌侵染马铃薯阶段，而有性生殖是在田间马铃薯致病疫霉交配型多，且病原菌无性生殖无法正常进行的条件下发生侵染[13]。

1.2 马铃薯致病疫霉的传播方式及侵染过程

马铃薯致病疫霉多发生于夏秋多雨的气候条件下，孢子囊可通过风、雨水、灌溉水进行传播。可以在潮湿土壤中随水分扩散而转移[14]，或通过起垄、耕作等田间农事活动被带到地表，遇到雨水溅到植株下部叶片上。马铃薯致病疫霉产生的孢子囊可将多核的细胞质分割成单核游动孢子，并在宿主的组织上生成附着包。附着包会产生一根胚芽管，该胚芽管可通过气孔进入叶片和茎[15]，侵染叶片形成中心病株。中心病株的气生孢子囊可通过空气传播或随雨水灌溉进行扩散，逐渐形成发病中心。严重时，马铃薯致病疫霉会导致全田植株发黑变苦，并伴随特殊臭味[16]。在马铃薯致病疫霉侵染植株的过程中，游动孢子的萌发是病害传播最重要的形式，所以，应从限制游动孢子的释放，孢子囊和游动孢子的萌发方面来阻断马铃薯致病疫霉的发生和传播。

2 马铃薯致病疫霉拮抗菌的主要种类及拮抗物质

2.1 芽孢杆菌

芽孢杆菌属由于其在各种环境中的优势、恢复力和生存能力，以及它潜在能够产生的生物活性分子的数量，是生物控制方法中的合适候选菌。自20世纪30年代中期以来，属于芽孢杆菌属的细菌，一直被用于生物防治策略。从那时起，人们对芽孢杆菌的兴趣与日俱增，并发现了许多显著的农业应用[17]。芽孢杆菌属的马铃薯致病疫霉拮抗菌有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，且随着研究的深入进展，将会有越来越多芽孢杆菌属拮抗菌会被发现和应用。

枯草芽孢杆菌因其具有高拮抗作用而被学者广泛发现和研究，王游游等[18]发现一株对马铃薯致病疫霉有高拮抗作用的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WL2，经研究发现其菌活体、菌液和无菌体发酵液抑菌带宽均大于26 mm，对马铃薯致病疫霉菌丝体致畸率达到38.7%，在该菌株最低菌液浓度(1×104cfu/mL)抑制下，释放游动孢子、孢子囊直接萌发和游动孢子萌发比率都是最低，依次为33.8%、28.3%和35.4%，此外WL2菌株在离体叶片和块茎上的相对保护率分别为81.2%和80.5%。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WL2具有产脂肽的能力，可产生伊枯草菌素A和枯草菌表面活性剂两类脂肽物质。脂肽物质对马铃薯致病疫霉均有一定的抑制作用[19]；Caulier等[20]在对芽孢杆菌对马铃薯致病疫霉的抑制作用中也发现了由枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌存在编码伊枯草菌素、丰原素和表面活性蛋白家族脂肽的遗传决定簇，产生的伊枯草菌素和丰原素家族的生物表面活性剂作为脂肽具有直接的抗真菌和抗卵菌活性。脂肽物质对马铃薯致病疫霉有显著的预防和治疗效果，其中预防效果明显优于治疗效果；此外脂肽可显著促进马铃薯块茎PPO、POD和PAL3种生防酶活性的提高且对马铃薯植株的生长有一定的促进作用，可促进植株叶绿素总含量提高，使根和茎的增粗增重，促进后代子薯增产[21]。

同时，Bhimanagoud等[22]研究了枯草芽孢杆菌MTCC-2422(T-3)、枯草芽孢杆菌KU936344(T-4)、枯草芽孢杆菌KU936345(T-5)和枯草芽孢杆菌KU936341(T-6)4株在大田条件下对马铃薯致病疫霉的生物防治效果。这些菌株产生霉菌毒素对抗病原微生物，细菌处理显著降低了马铃薯致病疫霉的发病率。

短小芽孢杆菌可产生纤维素酶。而马铃薯致病疫霉菌丝的细胞壁主要由纤维素和葡聚糖及少量的脂质和蛋白质组成[23]，卵菌能侵染植物的条件是细胞壁中纤维素的合成和存在[24]，微生物产生的纤维素酶可明显的抑制其孢子囊的形成[25]，进而降低其对植物的侵染能力。张荷花等[26]发现短小芽孢杆菌W-7在一定条件下同马铃薯致病疫霉对峙培养时和除菌过滤后的无菌体发酵液对马铃薯致病疫霉菌丝的抑制率大为不同，前者高达94.44%，而后者仅66.67%，两者之间显示出极显著差异(P＜0.01)；而且二者之间在引起马铃薯致病疫霉菌丝体畸变方面也表现出极显著差异，后经研究发现，W-7在黑麦培养基中马铃薯致病疫霉对峙培养时受其诱导产生纤维素酶，并通过该酶抑制了马铃薯致病疫霉菌丝的生长，同时引起菌丝体的畸变[26]。

Caulier等[20]发现有14株芽孢杆菌对马铃薯致病疫霉有很好的抑制作用(GIP≥50%)。经观察发现芽孢杆菌的强烈抑制作用可能与一些短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株产生的杆菌溶素有关。杆菌溶素可以抑制真菌甘露蛋白和几丁质生物合成且具有抗菌活性，因为它是葡萄糖胺合成酶的抑制剂，会干扰细菌肽聚糖的生物合成[27]。

除此之外，芽孢杆菌菌株是诱导系统耐药的潜在诱导子，可以降低疾病严重程度，其中解淀粉芽孢杆菌在这方面起的作用尤为突出。经解淀粉芽孢杆菌处理的马铃薯植株的防御相关酶如过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性较高，导致总酚的积累量高于未处理对照植株。Keerthana等[28]从茄科农作物马铃薯，番茄和龙葵的根际土壤中发现了解淀粉芽孢杆菌FZB 24菌株对马铃薯致病疫霉有较强的抑制作用，FZB 24显示出对马铃薯致病疫霉的最大抑制作用为35.56%。基于此初步筛选，FZB 24分别在温室和田间条件下又用于对马铃薯致病疫霉的进一步管理。温室研究表明，以玉米粉配方配制的解淀粉芽孢杆菌粉剂(FZB 24)为叶喷剂，比对照组显著降低了49.7%的马铃薯致病疫霉的严重程度。在田间条件下，解淀粉芽孢杆菌(FZB 24)处理的马铃薯小区马铃薯致病疫霉严重程度显著降低，块茎产量高于对照产量。

2.2 假单胞菌

假单胞菌是一个基因和表型多样的革兰蛋白杆菌属的成员。与植物相关的假单胞菌表现出显著的代谢多价性，确保了根际和叶际的适应性和竞争力，在根际和叶际，假单胞菌与宿主形成致病性、共生或互惠关系[22]，现已被研究用于对抗由真菌、细菌和卵菌引起的害虫和植物疾病。其中一些假单胞菌菌株通过释放挥发性化合物和通过扩散非挥发性代谢物在体外造成病原体生长的强烈减少[29]。

Mout De Vrieze等[30]对9株具有高拮抗作用的假单胞菌测序菌株进行基因组学分析，对菌株的表型特征及其综合基因库的比较分析表明，多种化合物和机制可能参与了对马铃薯致病疫霉的抑制、植物定殖和与其他微生物的竞争。他们的分析确定了几株拮抗菌来解释菌株的抗致病疫霉活性和马铃薯定殖能力，其中包括HCN、参与几丁质和蛋白质降解以及纤维素生物合成的酶、环脂肽、可能作为ABC转运体辅助成分的脂蛋白、胞外多糖、铁载体、细菌素和其他毒素以及不同的分泌系统。

Caulier等[20]发现假单胞菌产生的环脂肽(CLPS)具有直接的抗真菌和抗卵菌活性，可以使暴露于其中的游动孢子完全固定化和随后的溶解。其作用机制与芽孢杆菌脂肽一样，是游动孢子膜的增溶作用。他们筛选出的5株具有抗感染活性的假单胞菌中，有3株具有参与脂肽生物合成的遗传决定因子，且假单胞菌产生的一些脂肽，以及由芽孢杆菌产生的表面活性剂和丰原素家族的脂肽，具有在植物中触发ISR的间接拮抗活性，假单胞菌在体内外能产生生物表面活性剂和铁载体，它们的真菌毒性是通过质膜中的孔隙形成机制介导。

蓝希钳等[31]从土壤中分离出一株假单孢菌20#-5菌株，其发酵液或发酵液甲醇浸提物含有多种活性成分，对马铃薯致病疫霉的菌丝在平板上的生长有明显抑制效果[32]。Hunziker等[33]发现了一株假单胞菌(Pseudomonasspp.)的活体细胞及细胞悬浮液对马铃薯致病疫霉菌丝的生长有很强的抑制作用，抑制率高达90%以上，其中挥发性物质1-十一碳烯是从悬浮液中分离的活性拮抗成分，该物质能显著的抑制马铃薯致病疫霉菌丝体的生长及孢子囊的发育，抑制率达60%以上。Zegeye等[34]发现荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Bak150菌株对马铃薯致病疫霉菌丝也具有显著抑制作用，且抑制率达88%以上。

2.3 粘细菌

粘细菌作为革兰氏阴性真细菌，是具有社会性行为，可以改变形态并通过感应营养细胞间传递的信号进行滑动，群体捕食等[35]。粘细菌还可以产生数量多，结构新颖，种类丰富，作用层次高且机制复杂的次生代谢物，其对马铃薯致病疫霉的抑制在最近几年也被当作热门话题进行研究讨论。

武志华[36]通过研究发现内蒙古中部地区83%的粘细菌菌株对马铃薯致病疫霉具有抑制作用，其中以粘球菌属(Myxococcus)和珊瑚状珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)两个属的抗病菌株比例高。他筛选分离的黄色粘球菌B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质可有效抑制马铃薯致病疫霉的无性生殖和有性生殖，降低马铃薯致病疫霉菌体可溶性蛋白的含量和菌体保护酶(PPO、POD、SOD)的活性，增加细胞膜的氧化损伤和通透性。经检测发现，两种菌株产生的活性物质中拮抗组分均含有甲基（2R）-2-叠氮基-3-羟基-2-丙甲酯和氮-（3-氨基-2-羟丙基）-氮-甲基硫酸二胺两种物质。

任兴波等[37]筛选分离出了抗马铃薯致病疫霉菌株黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)YR-7和变绿粘球菌（Myxococcusvirescens）YR-35，菌丝生长抑制效果达到了96.67%，其中黄色粘球菌YR-7的发酵产物对菌丝的抑制率达50.90%，它产生的次生代谢产物可以有效的抑制马铃薯致病疫霉侵染马铃薯叶片；其团队分离出的变绿色粘球菌对马铃薯致病疫霉菌丝的生长具有抑制作用，抑制率达96.67%，拮抗活性物质在30～80℃处理1 h后菌丝生长抑制率达21.70%，大于80℃后活性下降，90℃时抑制率仍达15.38%。活性物质在pH 5.0～9.0条件下抑制率保持在25.27%以上，当pH＜5.0或pH＞9.0时，活性物质的抗菌活性明显下降[38]。

丁一秀[39]团队发现弱小珊瑚球菌(Corallococcus exiguous)、匣状粘球菌(Pyxidicoccusfallas)和珊瑚状珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)对马铃薯致病疫霉有显著的抑制作用。

3 展望

在日益追求生态环保的现在，化学杀菌剂终将会被抛弃，而转基因食品安全又存在争议，拮抗菌的研究和推广前景一片大好。目前对马铃薯致病疫霉拮抗菌的研究有很多，各种类拮抗菌层出不穷，但仍然存在一些研究深度及应用问题。

（1）国内对于马铃薯致病疫霉的微生物防治研究大多停留在拮抗菌对马铃薯致病疫霉各个发育阶段的抑菌效果这些表型层面，未来需要从分子层面深入剖析拮抗菌的抑制机理机制，从源头上寻找对马铃薯致病疫霉的抑制方法和对策，这对拮抗菌规模化产业化和广泛化应用也具有一定的帮助。

（2）很多拮抗菌在实验室条件下的抑菌效果非常显著，而在大田条件下的抑菌效果却不尽人意，这使得大部分拮抗菌的实际应用性能得不到保障，若能模拟大田条件进行多对一模式的多种菌在同一平板上同时和病原菌进行对峙实验，则可能筛选出在复杂条件下依然稳定拮抗的拮抗菌，且这种筛菌模式会大大减轻科研人员的工作量，甚至会批量产出高性能的拮抗菌。

（3）国内大部分对马铃薯致病疫霉拮抗菌的研究只关注其拮抗能力，但对其定植能力、应用后对作物的根际菌群影响方面的关注较少，未来可在研究拮抗菌的同时研究这两方面的影响，使拮抗菌可以更好得到应用。