Ki-67、p63、bcl-2蛋白在葡萄胎妊娠与水肿性流产中的诊断价值

李 烨，贺峻祎，祁明美，张友忠，郝春燕**，崔保霞

(1.山东大学齐鲁医院 a.妇产科;b.病理科，济南 250012；2.莒县人民医院病理科，莒县 276522)

妊娠滋养细胞疾病是一组临床上较为罕见的妊娠相关性疾病。葡萄胎(hydatidiform mole，HM)为最常见的妊娠滋养细胞疾病，其典型病理组织学特征为不同程度的滋养细胞增生和胎盘绒毛水肿[1-4]。根据病理形态、遗传和临床特征，HM又分为完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole，PHM)。水肿性流产(hydropic abortion，HA)是一种在组织形态学表现上类似于HM的非葡萄胎异常妊娠。CHM进展为妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)的风险约为15%～20%，PHM进展为GTN的风险约为0.5%～5%[4]，HA继发恶变的情况极为罕见，风险约为0.0002%。由于CHM、PHM和HA的临床管理及预后不同，在临床实践当中准确地鉴别三者非常重要。随着超声诊断技术的不断提高及血HCG值的监测，孕周较早的葡萄胎妊娠能够及时得以清宫处理。但是对于早孕期的组织样本，由于形态学上的重叠，单纯依靠病理组织学检查并不能完全区分CHM、PHM、HA这三种病变类型[5]。细胞遗传学发现分子基因分型技术对于鉴别三者具有重要意义，但是由于经济和技术等方面的原因，使得该方法在临床使用受限。因此，临床上需要一种快速、简便、低价的检测手段对葡萄胎各亚型之间、葡萄胎与水肿性流产之间进行精准鉴别。本研究旨在通过免疫组化染色检测Bcl-2、p63、Ki-67蛋白在CHM、PHM和HA中的表达情况，以评价它们在鉴别妊娠早期的CHM、PHM和HA中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集山东大学齐鲁医院病理科2012年1月至2018年6月的妊娠早期(<14周)CHM、PHM与HA样本共139例。由两位病理科医生分别对139例样本重新阅片，剔除形态学存在争议的样本14例，得到病理组织学诊断结果一致的样本125例。对125例样本行p57免疫组化染色,最后筛选出p57阴性的CHM 55例，p57阳性的PHM 29例，p57阳性的HA 40例，剔除1例p57阴性的HA。将最后筛选出的CHM、PHM及HA样本作为三个实验组。

1.2 主要试剂 鼠单克隆抗体Ki-67(1∶100稀释，UMAB107)、鼠单克隆抗体抗p57kip2(即用型，Kp10)、通用二步法检测试剂盒(PV9000)、DAB底物液(ZLI-9018)及EDTA抗原修复液(ZIL-9067)购自北京中杉金桥公司。兔单克隆抗体抗Bcl-2(即用型，SP66)与鼠单克隆抗体抗p63(即用型，4A4)购美国文塔纳医疗系统公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 采用免疫组化PV二步法。组织蜡块3μm厚连续切片，将切片置于60℃恒温箱中烘烤2h，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，置于EDTA抗原修复液(pH 8.0，1∶49稀释)高温高压修复抗原3min，自然冷却至室温。滴加内源性过氧化物酶阻断剂室温放置10min，滴加一抗4℃孵育过夜，PBS代替一抗作为阴性对照。复温后，滴加反应增强液37℃孵育30min，滴加二抗37℃孵育30min。DAB显色7～8min，苏木素复染，酒精梯度脱水、透明、封片。

1.3.2 结果评分 免疫组化染色结果由两位医师交叉双盲判定。p57绒毛间质细胞和细胞滋养细胞阳性细胞百分比>10%为阳性,≤10%为阴性。Ki-67与p63选取绒毛细胞滋养细胞着色最密集的部分，高倍镜(×400)计数100个细胞，统计阳性细胞百分比(阳性着色细胞数/计数细胞总数)。Bcl-2采用免疫反应积分(immunoreactivity score，IRS)来评分，即着色强度和阳性细胞百分比的乘积。阳性细胞百分比评分：高倍镜(×400)下随机选取5个视野，阳性细胞百分比<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。着色强度评分：不着色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、深褐色为3分。

1.4 统计学处理 应用SPSS23.0软件，结果以均数±标准差表示，三组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验及Bonferroni校正。受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线用于分析3种蛋白在不同实验组鉴别诊断的预测价值。对PHM与HA组p63、Ki-67蛋白表达情况行逐步logistic回归分析，两模型ROC曲线下面积的比较采用Mann-Whitney法。数据均为双侧检验，显著性水平为P<0.05。

2 结 果

2.1 p57、Ki-67、p63、Bcl-2蛋白表达情况

2.1.1 p57表达 p57主要表达于绒毛细胞滋养细胞、绒毛间质细胞和中间型滋养细胞的细胞核，合体滋养细胞的细胞核不表达。p57在PHM与HA的绒毛细胞滋养细胞和间质细胞中弥漫性表达，而在CHM的绒毛细胞滋养细胞和间质细胞中不表达或极少量表达(图1A～B)。

2.1.2 Ki-67表达 Ki-67主要表达于细胞滋养层细胞及中间型滋养细胞的细胞核，合体滋养层细胞及间质细胞的细胞核极少量表达(图1C～D)。Ki-67在HA、PHM、CHM组中的表达比较，差异显著(P<0.05)。CHM组中Ki-67蛋白表达显著高于PHM组(P<0.017),PHM组中Ki-67蛋白表达显著高于HA组(P<0.017)。见表1。

2.1.3 p63表达 p63主要表达于绒毛细胞滋养细胞的细胞核(图1E～F)，p63蛋白在HA、PHM、CHM组中的表达比较，差异显著(P<0.05)。HA组中p63蛋白表达显著高于PHM(P<0.017),而PHM与CHM组中p63蛋白表达无显著差异(P>0.017)。见表1。

表1 Ki-67、p63、Bcl-2蛋白在CHM、PHM及HA中的表达

2.1.4 Bcl-2表达 Bcl-2主要表达于所有的合体滋养细胞的细胞质，绒毛间质细胞及蜕膜细胞不着色(图1G～H)。Bcl-2蛋白在HA、PHM、CHM组中的表达差异显著(P<0.05)。Bcl-2蛋白在HA组的表达显著高于PHM组(P<0.017)，而在CHM与PHM组的表达无显著差异(P>0.017)。见表1。

2.2 ROC曲线分析

2.2.1 Ki-67用于鉴别CHM与PHM、PHM与HA的ROC曲线分析 ROC曲线分析Ki-67鉴别CHM与PHM的预测价值，Ki-67阳性百分比68.5%为最佳截断值，Ki-67阳性百分比>68.5%诊断CHM，AUC为0.666，95%置信区间0.533～0.799，敏感度为87.3%，特异性为55.2%，PPV 78.7%，NPV 69.6%，诊断的准确性较低。ROC曲线分析Ki-67鉴别PHM与HA的预测价值，Ki-67阳性百分比48.5%为最佳截断值，Ki-67阳性百分比<48.5%诊断HA，AUC为0.757，95%置信区间为0.626～0.888，敏感度为82.5%，特异性为72.4%，PPV 80.5%，NPV 75.0%，诊断具有一定的准确性。见图2。

2.2.2 p63用于鉴别PHM与HA的ROC曲线分析 ROC曲线分析p63鉴别PHM与HA的预测价值，p63阳性百分比为83.5%为最佳截断值，p63阳性百分比>83.5%诊断HA，AUC为0.898，95%置信区间为0.820～0.976，敏感度为95.0%，特异性为79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，诊断具有一定的准确性。见图2。

2.2.3 Bcl-2用于鉴别PHM与HA的ROC曲线分析 ROC曲线分析Bcl-2鉴别PHM与HA的预测价值，Bcl-2的IRS=8.5为最佳截断值，IRS>8.5诊断HA，AUC为0.680，95%置信区间为0.552～0.808，敏感度为45.0%，特异性为82.8%，PPV 78.3%，NPV52.2%，诊断的准确性较低。见图2。

2.2.4 Ki-67联合p63用于鉴别PHM与HA的ROC曲线分析 采用逐步logistic回归分析构建Ki-67联合p63鉴别PHM与HA的预测模型，同时获得该模型的相关预测概率。ROC曲线进一步分析此预测概率用于鉴别PHM与HA的预测价值，得到AUC为0.934，95%置信区间为0.868～0.999，敏感度为95.0%，特异性为79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，诊断的准确性较高。Ki-67联合p63用于鉴别PHM与HA的AUC(0.934)显著高于单独p63鉴别PHM与HA的AUC(0.898)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 ROC曲线A：Ki-67在鉴别CHM与PHM的ROC曲线；B：Ki-67、p63及bcl-2分别在鉴别PHM与HA的ROC曲线；C：p63联合Ki-67与单独p63分别在鉴别PHM与HA的ROC曲线

3 讨 论

3.1 p57辅助诊断完全性葡萄胎 p57具有印记基因的遗传特征，通常情况下为父源性等位基因被印迹，母源性等位基因得以表达。由遗传学可知，CHM的基因组主要来自于父方，通常是由1个空卵受精形成的双雄二倍体(46，XX或46,XY)。PHM的基因组来源于双亲，通常是由1个卵子和2个精子同时受精形成的孤雌双雄三倍体(69，XXX，69，XXY，69，XYY)。HA的基因组来源于双亲，是由1个精子和1个卵子受精形成的正常二倍体(46，XX或46，XY)。由于CHM不含母源性染色体成分，p57蛋白不表达，而PHM与HA的基因组均含母源性染色体成分，p57蛋白阳性表达。因此，p57免疫组化染色可辅助诊断CHM[6]，但是不能鉴别PHM与HA。

3.2 Ki-67在葡萄胎诊断中的研究 Ki-67基因参与了滋养细胞分化的调控，其表达的产物Ki-67蛋白是一种反应组织细胞增生程度的极佳标志物。有文献报道Ki-67在CHM、PHM与HA的表达情况，但并未得出一致结论。Moussa等[7]在运用p57染色与DNA倍体分析准确诊断CHM、PHM、HA的基础上，对这三组样本进行Ki-67染色，发现Ki-67蛋白在HA、PHM与CHM中表达逐渐增加，CHM表达显著高于PHM，PHM表达显著高于HA。本研究与Moussa等的研究结果一致，发现Ki-67抗原主要免疫定位于细胞滋养细胞的细胞核，CHM组中的Ki-67表达显著高于PHM组(P<0.017)，PHM组显著高于HA组(P<0.017)，诊断PHM与HA的ROC曲线下面积为0.757，具有一定的准确性。Khooei等[8]研究也证实了上述结论。但是，一项大样本分析[1]发现，Ki-67蛋白在HA、PHM与CHM中表达逐渐增加，但CHM与PHM之间，PHM与HA之间无明显统计学差异，不认为Ki-67能鉴别诊断PHM与HA。

3.3 p63在葡萄胎诊断中的研究 p63在葡萄胎妊娠中的具体作用机制，目前还不十分清楚，国内外已有一些文献研究p63在CHM、PHM与HA鉴别诊断中的作用，但是尚未得出一致结论。Ramalho等[9]和Masood等[10]通过p63免疫组化分析，发现细胞滋养细胞的p63着色强度在HM组显著高于HA组，差异有统计学意义，故认为p63可作为鉴别HM与HA的辅助诊断方法。Chen等[11]报道，PHM和HA的p63免疫表达结果无显著差异。Heidarpour等[3]研究发现，p63的核免疫反应性在葡萄胎妊娠高于非葡萄胎妊娠，在PHM组高于CHM组，但是对于上述鉴别诊断的进一步ROC分析结果却具有低的敏感度和特异性，因此并不推荐单独使用p63来鉴别HM与HA。本实验结果发现，p63在HA组大部分为极高表达，仅有1例样本为中等程度表达，表达显著高于葡萄胎妊娠组(P<0.017)。本研究结果显示，PHM中p63蛋白表达高于CHM，但无显著差异(P>0.017)。进一步ROC曲线分析p63在诊断PHM与HA的预测价值，得到AUC为0.898，敏感度为95.0%，特异性为79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，诊断具有一定的准确性。因此推荐使用p63作为辅助鉴别PHM与HA的方法之一。

3.4 Bcl-2在葡萄胎诊断中的研究 Bcl-2基因通过抑制细胞程序性凋亡而紧密参与了胎盘稳态、生长、重塑等过程。Erol等[2]研究发现，Bcl-2在HA、PHM和CHM中的表达逐渐减少，HA组Bcl-2表达显著高于PHM组，PHM组显著高于CHM组。因此，Erol等认为Bcl-2可作为一种相对可靠、经济且高效的辅助诊断方法来鉴别CHM、PHM和HA。但最近一项大样本研究发现，Bcl-2在HA、PHM与CHM中的表达逐渐增加，与Erol等结果完全相反[1]。本研究发现，Bcl-2蛋白在HA、PHM与CHM的绒毛合体滋养细胞胞质中表达逐渐减少；Bcl-2蛋白的表达在PHM与HA之间差异显著(P<0.017)，但在CHM与PHM组之间无显著差异(P>0.017)。进一步的ROC曲线分析Bcl-2在鉴别PHM与HA中的预测价值，AUC为0.680，诊断的准确性较低。此外，本研究还发现，Bcl-2蛋白在3组的合体滋养细胞中几乎均呈阳性表达，3组的Bcl-2表达阳性细胞百分比无明显差别(P>0.05)，差别主要表现在Bcl-2着色强度不同(P<0.05)。考虑到仅凭Bcl-2着色强度差异辅助鉴别PHM与HA，受观察者的主观影响较大，并且Bcl-2用于诊断的准确性较低，所以不推荐使用Bcl-2来鉴别诊断PHM与HA。

3.5 p63联合Ki-67对于PHM与HA的鉴别诊断价值 在临床实践当中，对于PHM与HA的诊断，除了分子基因分型之外，目前尚无较为特异的辅助鉴别方法，仍需进一步探究。本研究结果显示，Ki-67、p63用于鉴别PHM与HA具有一定的准确性，而Bcl-2用于鉴别PHM与HA的准确性较低，临床应用价值有限。本结果表明，相比于Ki-67染色，p63染色能以更高的准确性将PHM与HA鉴别开(p63/Ki-67的AUC、敏感度、特异性、PPV、NPV分别为：0.898/0.757，95.0%/82.5%，79.3%/72.4%，86.4%/80.5%，92.0%/75.0%)；联合Ki-67与p63染色组与单独p63染色组在敏感度、特异性、PPV及NPV方面结果完全相同，但是Ki-67联合p63组的AUC(0.934)显著高于单独p63组的AUC(0.898),差异有统计学意义(P<0.05)。因此，对于PHM与HA的鉴别诊断，联合使用Ki-67与p63比单独使用p63或单独使用Ki-67具有更高的准确性及应用价值。

综上所述，在无分子基因检测设备或患者因价格昂贵、耗时等原因不愿意接受分子基因检测情况下，对于葡萄胎妊娠与水肿性流产的诊断，临床上可结合病理形态学表现与p57免疫组化染色辅助诊断CHM，同时加用Ki-67与p63免疫染色辅助鉴别PHM与HA。