腺苷酸环化酶毒素的生物特性及其在百日咳疫苗中的潜在应用

张学 综述，江文文 审校

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明650118

腺苷酸环化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）是在百日咳杆菌对数增长期培养基上清中发现并纯化出来的，与细菌胞内腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）功能相似，可催化三磷酸腺苷（ATP）向环状单磷酸腺苷（cAMP）转化。在全细胞百日咳（whole cell per-tussis，wP）疫苗中也发现有 AC 活性的存在［1］，AC 与钙调蛋白结合后，其酶活性可增加100 ~ 1 000倍，钙调蛋白仅存在于真核细胞胞浆中，表明百日咳杆菌的AC 与真核细胞存在一定关系［2］，百日咳杆菌分泌的这种具有AC 活性的物质能穿透并进入真核细胞（吞噬细胞），使吞噬细胞内生成超生理水平的cAMP，从而降低吞噬细胞的杀菌能力。同时WEISS 等［3］将分离的1 株Tn5 转座子突变百日咳杆菌株（BP348），即无AC 活性和溶血活性的百日咳杆菌感染幼鼠后，其对幼鼠的毒力损伤比常规百日咳杆菌大幅减弱，且10 d 内可迅速从小鼠肺部清除，表明ACT 是百日咳杆菌感染早期所必需的定植毒力因子［4］。

1 ACT 的生物特性

ACT 由百日咳杆菌CyaA 基因编码表达，是其主要的致病因子之一，在百日咳杆菌感染呼吸道早期定植中发挥关键作用。ACT 全长含有1 706 个氨基酸，具有AC 活性和溶血素活性的双重功能，其完整的活性依赖于赖氨酸酰基转移酶（cyclolysin activating lysine acyltransferase，CyaC）基因编码的 CyaC对ACT 的860 和983 位赖氨酸进行棕榈酰化修饰。ACT 的N-末端364 个氨基酸残基具有AC 活性，即腺苷酸环化酶域（adenylate cyclase domain，ACD）；C-末端 1 342 个氨基酸（365 ~ 1 706 位氨基酸残基）负责AC 易位，具有溶血素活性，即溶血素域（hemolysin，Hly）［5］。ACD 在 C-末端 Hly 的辅助下进入靶细胞［6］，由胞内钙调蛋白激活并催化ATP 向cAMP超生理水平生成［7］。Hly 由以下几个区域组成：①易位域（translocation region，TR），即365~527 位氨基酸残基，参与ACD 转移至靶细胞过程，并可提高细胞膜的通透性，具有膜活性肽的特征；②疏水域（hydrophobic region，HR），即 528 ~ 710 位氨基酸残基，插入细胞膜并形成阳离子孔［8］；③酰化域（acylation region，AR），即711 ~ 1 005 位氨基酸残基，包括影响ACT有效折叠和AC 域移位的两个酰化位点（860 和983位赖氨酸）；④重复子毒素域（RTX domain，RD），即1 006 ~ 1 600 位氨基酸残基，由富含甘氨酸和天冬氨酸的9 肽重复序列形成5 个区段，可与靶细胞受体结合，另外，RD 也是钙离子结合位点，在钙离子的存在下，9 肽重复序列进行有序折叠，使ACT 具有AC活性［9］；⑥C-末端分泌信号肽（secretion signal，S），由细菌Ⅰ型分泌系统（typeⅠsecretion system，TⅠSS）识别［10］。

ACT 在细菌胞质中经CyaC 蛋白修饰为有活性的蛋白，破坏宿主固有免疫防御系统，穿透靶细胞，如巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、嗜中性粒细胞及非吞噬细胞［11］，使靶细胞内产生大量的cAMP，进而损害吞噬细胞的杀菌能力［12］，使百日咳杆菌能够在宿主呼吸道上定植。ACT 的AC 域易位进入表面有补体受体 3（CR3，CD11b ／ CD18）的靶细胞内分为两步［13-14］：①ACT 与分散在脂质筏外部的受体 CD11b ／ CD18 结合，使 CD18 亚基的胞质尾部通过连接蛋白（talin）束缚在肌动蛋白细胞骨架上；②与受体结合后，ACT 的“易位中间体”插入细胞膜的脂质双层，其中ACD 与Hly 一起渗透至细胞膜中，并参与瞬时打开Ca2+传导路径；细胞外的钙离子流入细胞，诱导Ca2+依赖性钙蛋白酶（calpain）活化，使 action 蛋白和 talin 蛋白裂解，ACT-CD11b ／ CD18复合物从肌动蛋白细胞骨架中释放；ACT-CD11b ／CD18 复合物募集至富含胆固醇的脂筏（lipid raft）中，其丰富的胆固醇和有序排列的磷脂分子帮助ACD 直接易位至宿主细胞的细胞质区，ACD 在胞质侧暴露后，驻留在细胞内的蛋白酶从ACT 上切下，经钙调蛋白（CaM）激活，催化ATP 向cAMP 超生理水平生成［15］。ACT 作用于巨噬细胞，通过 ACD 进入胞内催化ATP 产生大量cAMP 等机制直接减弱巨噬细胞黏附病原菌的能力［16］，还可触发成熟的初级肺泡巨噬细胞分化为单核细胞样细胞，抑制巨噬细胞的杀菌能力［17］。ACT 还可作用于 DCs，使 DCs 内的cAMP 浓度升高，高浓度的cAMP 通过增强丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化、抑制干扰素调节因子-1（inter-feronregulatory factor-1，IRF-1）和干扰素调节因子-8（interferon regulatory factor-8，IRF-8）的表达，进而促进免疫抑制细胞因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）的增多，并抑制促炎因子IL-12p70 生成［18］。有研究发现，ACT 通过激活半光氨酸天冬氨酸酶（caspase-1）和胞内危险信号［19］，如细菌穿孔毒素应答的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体，诱导DCs 产生和分泌IL-1β，使T 细胞应答向辅助性 T 淋巴细胞 17（T helper cell 17，Th17）型转变；ACT 通过破环DCs 介导百日咳杆菌免疫逃逸，同时减弱Th1，增强Th17 型应答，后者应答过强时，可能会加重肺部炎症和损伤。另外，中性粒细胞也是ACT 攻击的目标。在小鼠呼吸道攻毒模型中，ACT通过诱导胞内cAMP 信号转导及巨噬细胞环氧化酶-2（cyclooxy-genase-2，COX-2）的表达，从而释放具有趋化性的前列腺素，并在上皮DCs 细胞膜上形成的阳离子通道，随后钾离子外流、形成NALP3 炎症小体复合物、活化caspase-1、释放促炎因子IL-1β，从而招募中性粒细胞到达感染部位成为ACT 的攻击目标［20］。ACT 除了能损伤固有免疫反应的相关细胞，还能作用于适应性免疫反应的T 细胞。低浓度ACT 使 T 细胞分泌 IL-4、IL-13 等 Th2 型细胞因子，抑制 IFNγ 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等Th1 型细胞因子的生成，使T 细胞向Th2细胞分化，促进Th1 ／ Th2 平衡向Th2 偏移。大量的ACT 则可阻碍T 细胞活化，抑制T 细胞应答。ACT与 T 细胞上免疫突触（immunological synapse，IS）位置的淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）相互作用，使 LFA-1 过早脱离，并伴随talin 蛋白的断裂消失；IS 处是T 细胞受体（T cell receptor，TCR）和其他关键受体（如CD4／CD8、CD28 和LFA）微调和集成去驱动T 细胞活化的部位，因此该部位生成的cAMP 可有效地靶向T 细胞活化的途径，抑制T 细胞活化［21］。

综上所述，百日咳杆菌的AC 通过破坏固有免疫反应相关细胞和T 细胞来延迟细菌的清除和免疫记忆的发展。因此，在研发下一代百日咳疫苗时既要考虑引起机体的体液免疫，还要考虑激发特异性T细胞免疫来对抗病原菌［22-23］。

2 ACT 在百日咳疫苗中的潜在应用

2.1 作为保护性抗原的潜在价值 有研究表明，无论是主动免疫wP 疫苗，还是自然感染的人群血清中均存在一定的ACT 抗体［24］。ACT 作为百日咳杆菌的一个毒力因子，不仅在细菌感染宿主的早期阶段发挥重要作用，也是一个潜在保护性抗原。ACT 的保护性免疫原性依赖于CyaC 对983 位赖氨酸的修饰，可能是由于修饰的区域是免疫优势表位的一部分或CyaC 介导的修饰影响了分子构象，从而暴露出免疫优势表位［25］。全长ACT 作为抗原对机体有一定的保护作用，但ACT 本身的毒性（AC 活性）使其在疫苗应用方面受到一定限制。BETSOU 等［26］将天然ACT、重组ACT、ACT828-887（删除ACT 的828 ~ 887 位氨基酸）、ACT385-828（删除ACT 的385 ~ 828 位氨基酸）、ACT385-1489（删除ACT 的385 ~ 1 489 位氨基酸）、ACTC1307（删除 ACT 的 401 ~ 1 706 位氨基酸）、ACT217（删除ACT 的1 499~1 706 位氨基酸）免疫的小鼠为实验组，以未经免疫的小鼠为对照组，用百日咳杆菌活菌的亚致死量对小鼠进行鼻内攻击，结果表明，活菌攻击6 d 内，对照组小鼠肺部的活菌迅速定植并繁殖，而天然ACT 和重组ACT 免疫的小鼠肺内基本无百日咳杆菌繁殖，且3 d 后肺内百日咳杆菌迅速减少，截短的重组ACT 衍生物与对照组相似。WANG 等［27］用抗体噬菌体展示文库发现，抗体主要结合于ACT 的C-末端RTX 域，RTX 域具有免疫优势，能诱发中和抗体，封闭受体结合位点，表明RTX 域的结构完整性对其保护活性至关重要。另外还发现，用ACT 免疫的小鼠血清抗体可识别RTX域中两个新的不重叠中和表位，阻止了ACT 与小鼠单核巨噬细胞（J774A.1）结合，且RTX 域免疫小鼠的血清与ACT 免疫小鼠血清有相似的中和活性。对这两个表位的准确位置进行定位发现，RTX751（751 ~ 1 706 位氨基酸残基）与这两个表位的单克隆抗体亲和力最佳［28］。将RTX751 添加至适当剂量的无细胞百日咳（acelluar pertussis，aP）疫苗中，能增强小鼠抵抗百日咳杆菌感染的能力［29］。上述结果提示，在下一代aP 疫苗中，可考虑用RTX751 作为一种保护性抗原。

2.2 ACT 对共给抗原的佐剂效应 对wP 疫苗和aP 疫苗免疫后所引起的免疫反应类型分析表明，wP疫苗主要引起Th1 ／ Th17 细胞免疫，而aP 疫苗引起Th2 ／ Th17 型免疫［30］。ROSS 等［30］研究表明，在抵御百日咳杆菌的感染病程中，Th2 细胞免疫是非必须的，而诱导特异的Th1 型细胞免疫对百日咳的预防保护效果是重要的，在下一代aP 疫苗中应加入能诱导Th1 细胞免疫的佐剂，以此来提高aP 疫苗的保护效果。ACT 与百日咳杆菌的其他抗原组分共同免疫小鼠时，所得相应抗体水平均比单独使用这些抗原组分产生的抗体水平高。鉴于ACT 本身的毒性，MACDONALD-FYALL 等［31］通过基因技术在 ACT 蛋白的第188 和189 位氨基酸之间插入亮氨酸-谷氨酰胺二肽，得到一种无AC 活性的ACT 蛋白（ACT*）；CHEUNG 等［32］分别用 ACT、ACT*、翻译后未修饰的ACT（前体 ACT）、翻译后未修饰的 ACT*（前体 ACT*）联合aP 疫苗免疫小鼠，结果表明，与其他3 种蛋白比较，ACT*的佐剂效果最佳，可显著降低小鼠肺部定植的细菌数量，增加血清PRN 的IgG2a 抗体水平，促进脾细胞分泌大量IL-5、IL-6、IFNγ、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，GM-CSF）等细胞因子，还可促进巨噬细胞产生更高的NO 水平，表明aP 疫苗联合ACT*可将免疫反应从典型的Th2 型转变为混合的 Th1 ／ Th2 型反应，增强 aP 疫苗的保护力。另外，ACT*还能诱导DCs 成熟，使其发挥免疫相关功能［33］。因此，ACT*作为一种新型的aP 疫苗佐剂，具有良好的应用前景。

3 小 结

ACT 是百日咳杆菌的关键毒力因子之一，其免疫调节作用复杂且具有双向性，一方面ACT 破坏宿主免疫细胞，协助百日咳杆菌逃脱宿主免疫系统的攻击；另一方面ACT 类毒素可诱导保护性免疫应答。通过在ACT 的N-末端插入二肽，获得无（或低）AC 活性的ACT*作为佐剂，当其与aP 疫苗共同免疫小鼠时，可提高其他抗原的免疫原性，影响辅助性T 淋巴细胞的分化，协助aP 疫苗清除小鼠肺部定植的百日咳杆菌。因此ACT 有望成为aP 疫苗的候选组分，但其免疫原性、持久性和免疫效果尚需进一步深入研究。