自噬在肝脏疾病发生发展中的作用研究

覃小宾，张荣臻，曾胜澜，吴 聪，肖伟松，乐滢玉，毛德文

（1.广西中医药大学，2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

自噬是分解代谢的途径，它通过降解长寿蛋白和不必要的细胞成分达到自我更新，参与炎症反应、细胞死亡及免疫等在内的生理病理过程［1］。自噬几乎存在于所有的真核细胞中，且具有双向调节作用。当饥饿或营养不足时，可通过维持细胞能量水平来保护细胞免受内外环境的刺激；另一方面，在某些情况下，自噬又会导致细胞的死亡，又称程序性细胞死亡。适度的自噬具有保护作用，过度或失调的自噬则可促进细胞的死亡，导致疾病的发生发展［2］。

自噬按细胞内溶酶体降解的机制的不同可分成巨自噬、微自噬以及伴侣介导的自噬三种类型［3］，不过这三种类型自噬的最终目的都是复合底物的溶解。自噬的形成主要通过四个阶段，首先是自噬小泡对应激信号的成核阶段，其次是自噬前体通过联合蛋白质等形成复合物的延长阶段，再次是自噬前体融入溶酶体形成自噬小体的成熟阶段，最后是自噬小体在溶酶体内的降解阶段［4］。自噬过程受到自噬相关基因及多种信号传导途径的调控，目前已发现42 个自噬相关基因［1，4］。Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3KC3）［5］是 自 噬 基 因 之 一，主 要 由hVps34，p150 和Beclin-1 三部分组成，它催化磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）的形成，对自噬的起始起着重要的作用。在延长阶段中，能够定位到自噬体膜上的微管相关蛋白轻链3（LC3）需要在ATG 3 和ATG 7 与磷脂酰乙醇胺（PE）共价连接的脂化作用下将胞内LC3-I 脂化为LC3-Ⅱ，随后在噬菌体成熟阶段，共价连接的ATG 5/ATG 12 与ATG 16 相结合以形成噬菌体，并在LC3 脂化中起E3 样蛋白作用，故ATG 5、ATG 12、LC3-Ⅱ等相关自噬蛋白的含量代表了自噬水平的高低［6，7］。自噬不仅受自噬相关基因或蛋白的调控，同时也受多种信号传导途径调节，主要为Ⅰ类和Ⅲ类磷酸肌醇3 激酶（PI3K）途径和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途径，其中MAPKs 又包括细胞外信号调节激酶（ERK），p38 和c-Jun NH2-末端激酶（JNK）途径［8］。

1 自噬与病毒性肝炎

病毒性肝炎在全球死亡原因中排第七位，是世界范围内死亡和残疾的主要原因之一，慢性乙型肝炎（CHB）及慢性丙型肝炎（CHC）占大多数病毒性肝炎相关死亡率［9］。长期的病毒感染将加重肝脏的炎症反应等，最终导致肝纤维化、肝衰竭、肝癌等，自噬具有保护肝细胞免受内外环境的应激，清除细胞内不必要的蛋白质等成分及微生物病原体的作用［10］，即自噬具有抗病毒作用，但现有研究也表明在应激条件下，细胞也可利用自噬逃避先天免疫，保护细胞存活以促进病毒复制，目前尚无可完全清除肝炎病毒的药物，因此了解病毒在慢性感染者体内复制诱导的自噬机制成为潜在的治疗靶点之一。

1.1 自噬与HBV

HBV HBx 是HBV 的非结构调节蛋白，在细胞生理学、病毒复制、转录和发病等机理中有重要作用［11，12］，有研究表明，HBx 可能是HBV 复制所必需的［12-14］。HBV 诱 导 的 自 噬 是 由HBx 介 导 的［10，14-16］，其独立于Ⅰ类PI3K/AKT/mTOR 信号传导途径，而是主要通过激活ROS-JNK 促进Bcl-2 的磷酸化及Beclin-1/Bcl-2 缔合物的解离，导致Beclin-1 释放增加并形成与VPS34（Ⅲ类PI3K 的催化亚基）形成复合物的Ⅲ类PI3K（VPS34）/Beclin-1 依赖性途径增强自噬小体的形成，从而提高自噬水平，这可能是HBV 感染的潜在治疗靶点之一［13］。然而，独立于Ⅰ类PI3K/AKT/mTOR 信号传导途径并不意味着抑制该传导途径的抑制，HBx 仍然可以激活Ⅰ类PI3K/AKT/mTOR 信号通路，只是其对LC3-Ⅱ的累 积 没 有 显 著 影 响［13］。Rawat 等［12］发 现HBx 激 活了正常肝细胞内的AKT 并靶向作用于转录因子肝细胞核因子4（HNF4α），抑制了HBV 复制，但其同时也抑制了HBV 感染的肝细胞凋亡，产生了有利于延长HBV 复制的细胞环境，以此促进HBV 在肝细胞内持续复制，引起慢性感染。HBx 在诱导自噬以促进病毒复制的同时也诱导了由自噬介导的抗细胞凋亡导致的病毒免疫逃避机制［12，16，17］。肿瘤坏死因子超家族成员10（TNFSF10/TRAIL）在多种病毒中具有促进细胞凋亡的免疫监视作用，有报道称，敲除LC3B 及/或使用药物自噬抑制剂均可使HBx 诱 导 的 自 噬 下 调TNFRSF10B（TNFSF10 死亡受体）的表达从而使病毒感染的细胞免受TNFRSF10 的细胞毒性，起到逃避抗病毒免疫的作用，这可能是导致CHB 的原因之一［16］。可见，HBx 诱导的自噬在病毒复制和感染细胞凋亡及其导致的肝脏慢性感染中有着极为关键的作用。

HBV 通过HBx 的量决定了基础自噬的水平［10］，通过HBV 及HBx 表达质粒并瞬时转染肝癌细胞系和正常肝细胞，发现LC3 脂酰化和p62 蛋白降解水平均增高，证实了HBx 的确可以增强细胞的基本自噬［14］。虽然有一部分研究认为HBV 复制导致的自噬是HBx 诱导的，但也有研究表明包膜蛋白也是诱导自噬剂之一［15］。HBV 复制发生在肝细胞胞浆的病毒的衣壳内，核衣壳（NC）由病毒核心蛋白组成［12］。HBV 病毒核心依赖于Atg5-12/16L1 延伸复合体，RNAi 介导的Atg5、Atg12 和Atg16L1 的沉默促进了自噬载体的扩张和LC3 膜的结合，干扰了病毒核心/NC 的形成/稳定，并极大地降低了病毒产量［15］，即HBV 在自噬激活的延长阶段即可促进病毒成熟并复制增加，不需进行溶酶体降解阶段，调节Atg5-12/16L1 复合体可能是控制HBV 复制的手段。

1.2 自噬与CHC

HCV 是一种长9.6 kb 的单链包膜RNA 病毒，具有一个编码多聚蛋白的基因组，被病毒和蛋白酶加工成结构蛋白（CORE、E1 和E2）和非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B），其中非结构蛋白对病毒复制、组装过程和调节信号是必不可少的［7，8，18，19］，调节HCV 非结构蛋白的表达也不失为抗病毒的手段之一。

细胞膜重排和高尔基体碎裂是其复制的两个重要途径［20］。HCV 诱导的自噬除了具有通过对其蛋白质的降解来抑制HCV 的复制的功能，同时又有通过为抑制宿主的先天免疫反应来阻断IFN 信号或是为HCV 病毒颗粒的复制和组装提供自噬膜而促进HCV 的复制的作用［20］。IRGM 是位于高尔基体的干扰素诱导的GTPases 超家族之一，在HCV 感染后触发ULK1 的激活以诱导自噬，同时诱导AMPKα 和GBF1 的磷酸化导致高尔基体碎裂，以此两种途径共同促进病毒复制［20］，成为HCV 诱导的自噬的关键调节因子。

未折叠蛋白反应（UPR）是对内质网（ER）在应激条件下未能对新合成的蛋白质进行折叠或正确折叠的蛋白质进行识别并通过自噬机制将其进行降解的作用［21］。HCV 感染导致ER 应激和UPR 的诱导，Wang 等［19］发现HCV 核心蛋白上调了UPR 通路下游的ATF4 和DDIT3 的表达，使依赖于ATF4调节的ATG12 转录表达的增加，从而自噬诱导发生。Ke 等［22］则通过敲除Atg5/CHOP（UPR 的转录因子）证实了HCV 诱导的UPR 自噬抑制了病毒PAMP（病原体相关分子模式）介导的先天免疫，使IFNβ 产生减少并减弱抗病毒作用，以促进HCVRNA 的复制。

当受到氧化应激，转录因子Nrf2（NF-E2 相关因子2）就会从位于ER 上的Kelch 样ECH 相关蛋白1 中释放出来，逃避蛋白酶体的降解，移位到细胞核后与sMaf 形成异源二聚体，并与抗氧化反应元件（ARE）结合起到保护细胞的作用［23］。而也有研究认为ROS 应激性增高时sMaf 可被诱导到ER 上并与NS3 结合，使得释放出来的Nrf2 与ARE 结合受阻，导致Nrf2/ARE 依赖的防御机制受到损害从而维持高水平的ROS 应激，以持续诱导自噬的发生，促进HCV 病毒颗粒的释放，造成慢性感染。

与HBV 一 样，HCV 也 依 赖ATG5-12/16L1 复合物途径正向调节病毒的复制，ATG10 在ATG5-12/16L1 复 合 物 形 成 过 程 起 催 化 作 用［15，24，25］。而ATG10 具有较长的ATG10 和较短的ATG10S 异构体两个亚型，研究表明，这两个亚型在HCV 复制中起不同作用，ATG10 的过表达可通过干扰自噬小体的成熟导致自噬通量受损来促进HCV 的复制，反之，ATG10S 则通过激活天然免疫系统中Ⅲ型干扰素IL28A 的表达来促进自噬小体与溶酶体的融合以提高自噬通量，起到抑制HCV RNA 扩增的作用，可见ATG10S 和IL28A 的激活不乏为新的抗病毒机制思路［26，27］。

肝外泌体作为一种细胞信息的传递者，可以将病毒穿梭于肝细胞类细胞，并建立一种有效的感染机制［28］。研究表明，肝外泌体与自噬之间也存在关联，自噬敲除细胞释放的外泌体中细胞外感染性HCV 的水平显著降低，其机制可能与自噬沉默导致溶酶体功能障碍，损害晚期内涵体/外泌体在病毒感染细胞中向溶酶体的传递有关［29］。

2 自噬与非酒精性脂肪肝（NAFLD）

非酒精性脂肪肝［30］是一种代谢综合征，全球约有25%的成年人患有该病，长期存在的NAFLD 可导致肝硬化及其并发症，甚至是肝癌的发生，了解其病理生理有助于新治疗策略的提出。肝窦内皮细胞（LSECs）损伤发生在多种慢性肝病过程中，在从单纯脂肪变性到早期非酒精性脂肪性肝炎（NASH）阶段的进展中起着“守门人”的作用，是激活Kupffer 细胞和肝星状细胞（HSC）所必需的，又是慢性肝损伤的发展和持续的原因之一［31］。Hammoutene 等［32］观 察 到NASH 患 者 含 有 自 噬 空 泡 的LSECs 比无肝组织异常或单纯脂肪变性的少两倍，且自噬空泡的体积小于正常者，表明LSECs 损伤中存在自噬的缺陷，诱导了炎症分子的强烈表达导致了邻近肝星状细胞及促纤维化的血管生成通路的激活，同时导致LSECs 本身的功能障碍，促进内皮细胞向间充质转化、凋亡，在NASH 环境下促进肝脏纤维化形成［32］。

脂毒性是指脂质环境和/或细胞内脂质组成的失调，导致有害脂质的积聚，进而导致细胞器功能障碍、细胞损伤或死亡，其可通过增加蛋白质错误折 叠 和 诱 导ER 应 激 来 损 害ER 的 功 能［33，34］。线 粒体是脂毒性的靶点，Li 等［35］在用富含饱和脂肪酸的高脂饮食诱导的NAFLD 小鼠模型中发现位于线粒体内依赖NAD+的脱乙酰酶SIRT3 是一种自噬负调节因子且被激活或过表达，导致AMP 激活的AMPK 抑制和mTORC1 激活，进而通过诱导自噬抑制而加剧SFAs 触发的肝毒性。NAFLD 中存在自噬受损，且不同的自噬类型在NAFLD 进展中起不同作用。例如，ER 应激早期PI3K/AKT 通路被激活，网状吞噬抑制、脂毒性降低、bcl-2 表达增加，从而起到抗细胞凋亡的保护作用，而在网状吞噬消退后，损伤调节自噬调制器（DRAM）介导的有丝分裂吞噬降低，降低了bcl-2 表达，并起到促肝细胞凋亡作用［34］。不同类型自噬的功能或许可为治疗NAFLD 提供新策略。

3 自噬与肝纤维化（HF）

HF 是进展性肝病的重要特征，也是重要的治疗靶点，HSC 活化是其发生发展的中心环节，而LSECs 是HSC 活化及继发纤维化的调节因子。LSECs 具有维持肝细胞稳态的作用，HF 中存在LSECs 损伤及其依赖性的自噬缺陷，导致炎症反应的持续发生，使LSEC 抗氧化应激下降，同时TGFβ1的过度表达促进HSC 的活化，引起HF 的发生或加 重［32，36］。Kim 等［37］发 现HSC 中 的miR-16 失 调 导致鸟嘌呤核苷酸结合α 亚单位12（Gα12）过度表达，促进c-Jun N-末端激酶依赖性ATG12-5 形成的自噬来激活HSC，从而促进了肝纤维化的进展，提示了Gα12 及其调节分子可以作为改善肝纤维化的新靶点。脂多糖（LPS）泄漏发生在HF 的非常早期，Chen 等［38］在LPS 诱导的肝纤维化小鼠中发现其诱导的自噬依赖于AKT-MTOR 和AMPK-ULK1 途径，导致HSC 中自噬体形成和自噬通量的急剧增加，降低了视黄酸的信号传导，使视黄酯分解代谢，提供游离脂肪酸以增加ATP 的产生，下调Bambi 的表达并促进HSC 对转化生长因子（TGFB）的纤维化反应的敏感性，引起HF。

4 自噬与急性肝衰竭（ALF）

与慢性肝病相比，急性肝衰竭较为少见但预后极差，其特点是炎症介导的大面积肝细胞损伤，通常均伴随着肝细胞凋亡和坏死。很多研究已证实糖原合成酶激酶3β（GSK3β）在调节细胞的激活、分化和存活方面起重要作用，近年来其在炎症过程中的作用也逐渐被发现［39-41］。在ALF 的进程中，GSK3β 活性增加，导致氧化应激使得导致肝损伤，抑制其或许可以减少ER 应激诱导的细胞凋亡［42］。Ren 等［43］在D-氨基半乳糖（D-GalN）和LPS 诱导的小鼠ALF 模型中发现自噬受到了抑制，并且通过抑制GSK3β 发现其增加了过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）介导的自噬和降低了炎症因子及Toll 样受体4 的表达，保护肝细胞免受凋亡，提出了GSK3β 活性升高介导的PPARα 抑制自噬为ALF 的致 病 机 制。Liu 等［44，45］同 样 在D-GalN 和LPS 诱 导的ALF 小鼠模型中发现肝细胞自噬被抑制，miR-19a 可 上 调AMPK/PPARα 信 号，且AMPK 的 激 活可以通过抑制炎症和上调FOXO3a 的表达来激活自噬来改善ALF。由此，可认为AMPK 或PPARα激活剂的研发或许成为肝衰竭治疗的新策略。

5 自噬与原发性肝癌（HCC）

肝癌是常见癌症之一，其死亡率正在以比其他癌症更快的速度增长，多以肝细胞癌（HCC）为主［46］。由于肝癌早期诊断率及治愈率低，而自噬的生理功能通常被认为有助于改变人的病理状态，但癌症中处于营养缺乏及缺氧环境的肿瘤细胞却可利用自噬得以存活而影响癌症的发生发展，故深入了解自噬在肝癌发生发展中的机制对于抗癌药物的研发有重要意义。在我国，HBV 感染是肝癌发生的常见原因，已有研究表明HBx 介导的自噬参与HBV DNA 的复制与包膜，与慢性HBV 感染有关并影响HBV 相关性肝癌的发展［10-13，15］。不过，自噬对肝癌也并非都是促进作用，Mao 等［17］发现HBx 激活的自噬虽然对病毒复制有积极影响，但在营养缺乏的环境下肝细胞的自噬作用增强也促进HBx 的抗凋亡作用，提高了肝和肝癌细胞系的存活率。

长非编码RNA HULC 在多种癌症的发展中起积极作用，现越来越多证据表明HULC 在肝癌中过表达并在肝癌的发生发展中扮演重要角色［47，48］。Xin 等［49］阐明了HULC 作为致癌基因在肝癌中的作用，发现其不仅可以通过自噬基因p62 介导的泛素-蛋白酶体系统抑制张力素同系物，激活AKT-PI3KmTOR 通路以增强自噬通量，促进肝癌发生，还可以通过参与肝脏脂质代谢，加重肝脏损伤，阐述了通过调控其在肝脏中的表达为肝癌的治疗提供切入点。与HULC 类似，Cullins-1 调节蛋白（ROC1）在肝癌中高表达，是包括肝癌细胞在内的多种癌细胞系生长所必需的，ROC1 基因敲除时MTOR 活性被抑制而触发自噬，抑制肝癌细胞的生长［50，51］。与致癌因子不同，烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）作为一种代谢调节因子虽被发现其参与肝癌的发生，但其在肝癌细胞中表达受到抑制［52］。Shin 等［53］发现NNMT 是一种自噬负调节因子，其作用依赖于ULK1 的激活，抑制其可诱导自噬从而保护肿瘤细胞免受营养剥夺，加速肝癌的发展。

6 小结

综上，可认为自噬在肝脏疾病的不同阶段有不同作用，不同的自噬类型亦有不同的作用，故明确自噬在肝脏疾病发生发展中的机制，有助于新治疗策略的提出，为肝脏疾病治疗提供新思路。虽然目前针对自噬作用在肝病中的研究已较多，但仍需进一步的研究来全面剖析自噬在肝脏相关疾病的诱导和进展中的详细作用，以期为临床防治提供方向及证据，提高肝脏疾病的存活率。