内皮间质转化参与异位骨化的研究进展△

田 鹏，刘 军，马信龙

（天津市天津医院，天津市河西区300211）

异位骨化（heterotopic ossification,HO）是指机体在没有骨组织的软组织内出现新的骨形成的病理现象，主要原因包括创伤、神经源性以及遗传因素等［1，2］。创伤性HO常见于如关节周围骨折、人工关节置换术后等［3］。神经源性HO则与颅脑损伤、脊髓系统损伤相关［4］。遗传性HO较少见，主要是进行性骨化性纤维发育不良（fibrodysplasia ossificans pro⁃gressiva,FOP），患者可以终生出现进行性HO，在肌肉组织中引起肿瘤样肿胀，且出现急性炎症过程周期性发作，并在炎性区域形成软骨和骨［5］，但这一过程中的具体分子机制目前尚不清楚。

近年来有关HO的发病机制取得一定的进展，从最早的三因素学说，即成骨前体细胞、成骨诱导刺激和适宜的骨形成组织环境；到最近的四因素学说，即初始刺激因素、信号因子通路、未分化的干细胞和局部微环境，其发病机制逐步被掌握，但通过分析目前HO发病情况，可以发现HO的病理生理学机制和骨折愈合过程相似，这给创伤骨折患者在促进骨折愈合及HO预防方面带来了挑战。

内皮间质转化（endothelial-mesenchymal transi⁃tion,Endo-MT）是上皮间质转化（epithelial-mesen⁃chymal transition,EMT）的特殊类型，其特征是细胞-细胞粘附丧失和细胞极性发生剧烈变化，从而产生长梭形细胞，内皮标志物如CD31、VE-钙粘蛋白、血管生成素受体-1（Tie-1）和血管性血友病因子（vWF）表达减少，而间质标记物如成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein 1,FSP-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达增加。Endo-MT后形成的间充质细胞具有较强的增殖和迁移能力，能够在生理或病理条件下产生各种组织类型［6］。目前关于Endo-MT和HO的研究逐渐增多，本文就近年来国内外关于Endo-MT的特点、发生机制以及在HO中作用的相关研究进展作一综述。

1 Endo-MT的特点及在发育和疾病中的作用

Endo-MT是内皮细胞在多种因素作用下向间充质细胞转化的动态过程，其被证实能够促进胚胎发育过程中心脏瓣膜和间隔的形成［7］，同时也被证实在某些病理条件下如心脏、肾和肺的纤维化［8］、肿瘤进展［9］、以及伤口愈合过程中发挥作用。

内皮细胞通过Endo-MT成为肌成纤维细胞的来源，从而促进脏器纤维化。同样Endo-MT在静脉移植后血管重塑过程中发挥重要作用［10］。在肿瘤微环境中Endo-MT有助于形成肿瘤相关成纤维细胞，在癌细胞转移性外渗中发挥作用［11］。在机体受到损伤或产生炎症后可能会激发这种机制从而在伤口愈合或纤维变性期间产生成纤维细胞和肌纤维母细胞形成瘢痕组织［12］。

2 Endo-MT与HO

最近有研究证实在HO小鼠模型中发现异位软骨和骨细胞能够表达内皮标志物如Tie1、Tie2、vWF和VE-钙粘蛋白，同样FOP患者的HO病灶中约50%的软骨和骨细胞能够表达各种内皮标志物（Tie1、Tie2、vWF和VE钙粘蛋白），来自正常的骨或软骨组织的成骨细胞和软骨细胞不表达这些内皮标志物［13］。探讨血管内皮细胞是如何转化为异位软骨及骨已经成为了近来的研究热点。

血管内皮细胞一般经过Endo-MT成为成纤维细胞，内皮细胞通过Endo-MT发生去分化后达到干细胞表型，然后可以分化为骨、软骨或脂肪细胞。也有研究结果表明脂肪组织中的血管内皮细胞可以通过发生Endo-MT变为白色和棕色脂肪细胞［14］。探讨导致内皮细胞发育和病理衍生出其他细胞谱系的具体机制，是未来该领域的研究热点。

也有学者提出参与异位骨形成的细胞不仅限于间充质谱系的细胞，还有包括造血起源的循环细胞，在炎性组织中充当成骨前体细胞，但是其具体转化分子机制目前尚未完全清楚。有研究证实表达Tie-2的内皮前体细胞能够响应周围炎性反应，通过软骨内途径分化，且在HO形成过程中的每个阶段都发挥作用［15］。其他的候选细胞可能是周细胞，驻留在肌肉组织内干细胞也显示出具有成骨的能力［16］。在进行性骨化性肌炎中内皮祖细胞可能有助于HO，而不是来自现有血管的成熟内皮，内皮祖细胞表达相同的标志物，虽然比成熟内皮细胞表达水平偏低［17］。循环内皮祖细胞可以被募集到早期FOP病变作为炎性反应的一部分，并经由Endo-MT促进HO的形成。深入探究Endo-MT具体调节机制对HO的预防具有重要意义。

3 Endo-MT的相关信号通路

既然Endo-MT与HO形成有密切关系，因此需要明确Endo-MT的相关信号通路，寻找合适的分子靶点，为预防HO提供帮助。TGF-β和Notch信号通路是调节Endo-MT的常见因素，但是启动Endo-MT的是Notch通路还是TGF-β，亦或是两者协同作用尚需要未来进一步研究。另有Wnt信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、MicroRNAs、血管内皮生长因子（VEGF）等因素也可通过调节TGF-β通路来影响Endo-MT的进展。

3.1 TGF-β信号通路

TGF-β属于多功能蛋白质，其能够影响细胞的生长、分化、凋亡。TGF-β诱导的Endo-MT需要两种途径包括Smad依赖性和Smad非依赖性信号通路。虽然抑制ALK2和ALK5都能抑制TGF-β诱导的Endo-MT，但是ALK2和ALK5下游信号通路不同，ALK2信号通过Smad1/5/8，然而ALK5信号通路通过Smad2/3［18］。也有研究证实抑制Smad4蛋白的表达能够阻断TGF-β2诱导的Endo-MT，同样PI3K、MEK和p38 MAPK信号通路的化学抑制剂也能够成功阻断 TGF-β2诱导的 Endo-MT［19］。因此，抑制ALK2、ALK5或其几个下游信号传导通路可能有助于阻止依赖Endo-MT的HO的形成。有研究证实内皮细胞对TGF-β的响应依赖TGF-β的剂量以及周围微环境，触发Endo-MT的信号通路可能在发育和病理条件之间变化［20］，因此，TGF-β诱导Endo-MT的具体机理需要进一步探究。

3.2 Notch信号通路

Notch信号通路几乎影响所有细胞的增殖、分化和凋亡，且在一系列生理以及病理过程中都发挥重要作用。Notch的受体和配体在造血干细胞发育过程中的不同阶段其表达存在差异，从而显示Notch信号通路在细胞发育不同过程中作用也不同。细胞因子能够影响造血干细胞的增殖和分化，但是具体分化方向受到细胞间相互作用的影响，而Notch信号转导通路可以作为细胞间相互作用的枢纽。

Notch和TGF-β类似，都能够诱导内皮细胞发生Endo-MT。Notch能够调节转录因子Snail、Slug以及ZEB1的表达来诱导体外培养的内皮细胞发生En⁃do-MT。Notch信号能够上调细胞内Smad3 mRNA，稳定Smad3蛋白，其与TGF-β因子能够协同调控Endo-MT。有研究证实内皮细胞能够通过细胞间的接触和激活Notch信号来促进平滑肌的钙化［21］。Notch信号能够平衡内皮细胞发生Endo-MT后的增殖和凋亡，其成分的突变可能导致人类主动脉瓣先天性异常和瓣膜狭窄［22］。

3.3 Wnt信号通路

Wnt信号通路能够介导多种生物学过程，如胚胎生长发育、代谢调节以及维持干细胞的状态。Wntβ-连环蛋白（β-catenin） 通路作为最经典的通路，β-catenin是Wnt信号通路中的关键蛋白。有研究证实β-catenin能够在细胞质中聚集并进入细胞核内后结合TGF-β转录因子，然后激活Wnt靶基因，最终促使发生 Endo-MT［23］。

3.4 HIF-1信号通路

低氧诱导因子-1也是细胞生长过程中重要的调控因子，HIF-1能够调节细胞的代谢，从而影响细胞增殖和分化，继而影响人体的病理生理活动。HIF-1介导机体对缺氧和缺血的代谢适应，包括从氧化代谢向糖酵解的转变。在胚胎发育过程中，HIF-1保护胚胎不受宫内缺氧的影响，若缺失或强制表达对胚胎是致命的。有研究证实HIF-1能够通过活化TGF-β-R1/Smad信号通路继而导致人肺动脉内皮细胞出现辐射诱导 Endo-MT［24］。

3.5 MicroRNAs与Endo-MT

近来研究关注到microRNAs与Endo-MT的关联，证实microRNAs通过调控Endo-MT影响心血管的重塑、脏器纤维化和肿瘤等进展。虽然Endo-MT和上皮-间质转化具有相似的过程，但是microRNA在调节Endo-MT具体机制目前尚不清楚，有研究证实miR-630能够靶向转录激活因子Slug从而抑制Endo-MT减轻创伤后HO的形成［25］。也有学者证实NF-κB/miR-21/Smad7通路在1型糖尿病和糖尿病心肌病中调控Endo-MT过程，从而影响疾病的进展，指出这可能是治疗心血管性纤维化的潜在临床治疗靶点［26］。

3.6 VEGF

VEGF是重要促血管生成的生长因子，对内皮细胞具有促进有丝分裂和抗凋亡作用，其能够增加血管通透性以及促进细胞迁移等。由于这些作用，它积极参与调节正常血管发育和病理血管生成。有研究证实了在胶质母细胞瘤中存在复杂的促血管生成和抗血管生成通路，包括TGF-β和VEGF/PLGF信号的交叉表达，这可能涉及不同靶细胞群中血管生成和Endo-MT的平行刺激［27］。最近研究发现VEGF也是Endo-MT的抑制剂，因为它可以抵消TGF-β2信号通路的效应［28］，但是目前尚不清楚这种背景下VEGF的下游效应器，当前这些研究表明重组VEGF可能是HO的潜在抑制剂。

4 抑制Endo-MT的相关药物

未来的研究应该关注HO新的治疗策略即如何抑制HO中Endo-MT介导的细胞分化。目前有关药物抑制Endo-MT的方面，既有涉及HO领域的，也有尚未涉及HO方面的。Nintedanib［29］通过抑制内皮细胞间质转化和平滑肌细胞增殖来改善实验性肺动脉高压；甲氧基雌二醇能够下调依赖HIF-1的Smad信号，从而抑制放射诱导的Endo-MT［24］；藤黄酸能够通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路逆转Endo-MT从而减少肺纤维化［30］；松弛素能够通过Notch介导En⁃do-MT来抑制心脏纤维化［31］。AMP依赖的蛋白激酶抑制剂-Dorsomorphin和ALK2抑制剂LDN-193189能够成功抑制小鼠的HO［32］。尽管帕罗伐汀在体外抑制了FOP幼龄小鼠的软骨分化并降低了HO，但每日给药可导致侵袭性滑膜关节过度生长和长骨生长板消融，这些结果反映了在骨骼成熟之前抑制病理性骨形成仍存在的挑战［33］。

5 展望

Endo-MT在HO的病理过程中发挥核心作用，为预防HO提供新的策略和理论依据，这既是临床工作者的挑战也是临床科研工作者努力的方向。