我国甲型肝炎疫苗的研制及应用历程

宋洁玉 王松梅 汪萱怡复旦大学附属华山医院感染科，上海0000；复旦大学生物医学研究院暨教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海000；复旦大学基础医学院医学实验教学中心，上海000；上海市重大传染病和生物安全研究院000；复旦大学附属儿科医院，上海0110

宋洁玉和王松梅对本文有同等贡献

甲型肝炎是一种古老的疾病，主要通过粪-口途径传播，人群对其普遍易感[1-3]。甲型肝炎在世界各地均有流行，我国曾属于甲型肝炎高度流行区[4]。1988年，由于江苏吕泗港海域毛蚶被污染，导致上海甲型肝炎大流行，发病率超过4%，总临床病例数高达29.2万[5]，之后，在党和政府的大力支持和推动下，我国甲型肝炎疫苗的研制开始加速，并获得了成功，有效地控制了甲型肝炎在我国的流行。

一、我国已上市甲型肝炎疫苗的研制

我国甲型肝炎疫苗研制始于1985年，被列为国家“七五”重大科技攻关项目，由浙江省医学科学院病毒所毛江森主持，中国医学科学院医学生物学研究所与中国药品生物制品检定所共同参与开发。根据当时的社会条件，我国甲型肝炎疫苗的研制首先采取减毒活疫苗，到“九五”期间，甲型肝炎灭活疫苗的研制又被列入国家重大科技攻关项目，由中国药品生物制品检定所李成明、张华远主持，联合唐山怡安生物工程公司与中国医学科学院医学生物学研究所共同开发。迄今，我国共有2株减毒活疫苗、3株灭活疫苗批准上市。

1.减毒活疫苗H2株

1978年9—12月，杭州近郊一个81户486名居民的村庄因饮用水源污染，导致67人罹患甲型肝炎。毛江森等在调查中对该村56名17岁以下与一代病例有接触史、尚未发病的居民进行粪便样本采集，随后其中26名被诊断为甲型肝炎[6]。从这批病例黄疸前期或转氨酶升高前的粪便样本中初提取到3份病毒抗原液，分别命名为杭州甲-1、杭州甲-2与杭州甲-3，其中杭州甲-2来自于样本号为T-086的12岁男性病例粪便样本，抗原滴度较高[6-7]。1980年，用原代猴肾细胞于35℃培养分离而获得原代野生毒株H2株。1985年，毛江森等与中国医学科学院医学生物学研究所董德祥等合作，将分离的病毒通过细胞传代减毒，先在原代猴肾细胞中传20代，其中前15代置35℃，后5代置32℃，为H2M20株；其后再在KMB17人胚肺二倍体细胞于32℃连续传5代[8]。其安全性和免疫原性得以证实，由此建立了疫苗种子库的原始种子[9]。K5株再用KMB17细胞传2代，获得H2M20K7（K7）株为主种子；K7株再经KMB17细胞连续传代三次，建立了K10株为工作种子[8]。1987年用K5株生产的实验性疫苗在12名18~27岁健康志愿者中进行了安全性与免疫原性的初步观察[10]，其后至1989年又在11 439名4~12岁儿童中进一步验证了安全性与免疫效果[11]。1992年3月获原卫生部颁发的新药证书。

2.减毒活疫苗LA-1株

1980年底，黑龙江省的几个托儿所发生了甲型肝炎流行，黑龙江省卫生防疫站从住院患儿发病早期收集的粪便样本中获得了一批抗原液，命名为龙甲-X，其中龙甲-1粪便样本来自哈尔滨市1例2岁王姓男患儿[12]。1983年底，上海市卫生防疫站胡孟冬与黑龙江省卫生防疫站合作，从龙甲-1抗原液中用人胚肺二倍体细胞（SL7）于32℃培养分离到HAV，为LA-1原代野生毒株[13]。该毒株先经SL7细胞于32℃传7代，后经人胚肺二倍体细胞2BS分别于32℃条件下传4代和35℃条件下传7~14代，进行绒猴感染实验及攻击保护实验验证，获得LA-1减毒株[14]。1989—1991年，实验性疫苗在380名健康志愿者（主要为12岁以下儿童）中进行了安全性与免疫原性研究[15-16]，于1992年获原卫生部颁发的新药证书。

3.灭活疫苗TZ-84株

1983年10月，河北省唐山农村发生甲型肝炎暴发事件，唐山市卫生防疫站尹卫东收集了患者早期的粪便，于1984年同中国预防医学科学院病毒学研究所一起用人胚肺二倍体细胞2BS，从1例唐山5岁张姓女患儿粪便中分离到TZ-84原代野生毒株[17]。TZ-84株在2BS细胞中于32℃传代，构建了疫苗用毒株，由此毒株制备成甲型肝炎灭活疫苗[18]。1998—1999年以葛兰素史克公司的甲型肝炎灭活疫苗作为对照疫苗，TZ-84株制备的疫苗在18～22岁和5～15岁成人与儿童易感人群中均具有良好的安全性和免疫原性[19-20]。该疫苗自1996年开始研制，2002年获新药证书。

4.灭活疫苗Lv-8株

1988年初，上海及周边甲型肝炎大流行，中国医学科学院医学生物学研究所从南通吕泗镇甲型肝炎患者中收集发病早期粪便样本，其中样本号为吕8、合34与合52的粪便样本于1988年4月用人胚肺二倍体细胞KMB17在35℃进行了病毒分离[21]。吕8样本分离的毒株在KMB17细胞上35℃培养28 d适应6代，再以12 d为一代适应培养19代共25代，测定其感染性滴度达8.22 log10CCID50/mL，作为甲型肝炎灭活疫苗候选株[22]，此候选毒株制备的灭活疫苗接种普通狨猴和恒河猴均有较好的抗体反应，可抵抗HAV强毒株的攻击[22-23]。2001年在广西176名儿童与206名成人中进行临床试验，结果具有良好安全性和免疫原性[24]，2003年获国家药品食品监督管理局新药证书。

5.灭活疫苗YN5

1995年3—9月，云南沃森生物技术有限公从昆明铁路中心医院收集到6份甲型肝炎急性期患者粪便，分别编号为YN1~YN6。于35℃接种人胚肺二倍体细胞2BS，传5代后转而接种Vero细胞35℃再传14代，结果仅有YN5株能适应Vero细胞，感染性滴度达8.23 log10CCID50/mL[25]。该毒株经传代后作为候选毒株并制备灭活疫苗，疫苗接种普通狨猴具有较好的免疫原性[26-27]，该候选疫苗于2004年12月至2005年7月在广西开展临床试验，于2009年2月由上海泽润生物科技有限公司获国家药品食品监督管理局新药证书。

二、我国甲型肝炎疫苗的有效性与持久性研究

作为国家“八五”重大科技攻关项目，由中国医学科学院医学生物学研究所董德祥主持，于1991年在湖南、四川、广东、云南和山东5个省采用非随机对照的开放性设计，对H2株与LA-1株减毒活疫苗进行了大规模人群（92 700名受试对象）保护效果观察。结果表明减毒活疫苗安全性良好。对湖南株州和岳阳两地前瞻性队列研究结果进行分析，2种疫苗保护效果均在90%以上[28]。

上海医科大学徐志一在河北正定、江苏苏州采用随机对照开放性试验设计，在57 700名0~13岁儿童中评价了H2株与LA-1株减毒活疫苗效力：河北正定现场测得H2株疫苗效力为70.9%[29]；苏州现场测得H2株与LA-1株疫苗效力分别为76.1%与72.4%。应用Abbott试剂与WHO anti-HAV标准品测得H2株和LA-1株疫苗1剂免后3个月的抗体阳转率分别为36.3%和35.3%[30]。大规模的临床试验结果表明，1剂减毒活疫苗接种后免疫原性及效力均不理想，可能是疫苗滴度偏低（估计约为5.0～5.5log10CCID50/mL）所致。为此，1994年徐志一在河北正定将甲型肝炎易感儿童随机分为4组，分别接种剂量为106.83TCID50、106.5TCID50、106.17TCID50的活疫苗，以及将106.83TCID50剂量疫苗以60℃3 h灭活的疫苗，免后3个月抗体阳转率分别为95.7%、90.4%、79.5%与73.9%，呈明显剂量效应关系。结果表明，提高疫苗滴度，有望提高抗体阳转率与保护率，规范化活疫苗剂量应在106.5TCID50以上。此建议被原卫生部采纳，自1995年1月起，要求疫苗滴度提高到106.5TCID50以上[31]。

1996年，徐志一对提高滴度的减毒活疫苗在广西、河北、上海等地457 251名受试对象中进行随机对照试验，随访3年评价免疫原性与保护效力。结果H2株（107.0TCID50）与LA-1株（106.75TCID50）疫苗保护效果均达95%，抗体阳转率峰值分别出现在疫苗接种后2个月与6个月，为94.9%（GMT：131.3 mIU/mL）与86.0%（GMT：122.7 mIU/mL），具有很好免疫原性与保护效力[31]。

复旦大学上海医学院汪萱怡通过对1996年在河北建立的甲型肝炎减毒活疫苗长期纵向队列持续17年的研究，发现接种疫苗1剂免后17年抗体阳性率为68.4%，GMT为73.3 mIU/mL（95%CI：57.4~93.5 mIU/mL）[32]。选择该队列中一个村共51名观察对象，检测甲型肝炎减毒活疫苗1剂免疫后17年研究对象的外周血淋巴细胞，发现所有研究对象中疫苗诱导的甲型肝炎特异性T细胞免疫记忆及B细胞免疫记忆均存在，无论甲型肝炎抗体阴性或阳性，且免疫记忆应答水平与其甲型肝炎抗体水平无关。上述研究对象再接种1剂活疫苗2周后检测发现，接种前无论抗体能否检测到，再接种后均能诱导良好的细胞免疫，以CD8+T细胞免疫反应最为显著，反映了活疫苗的特性[33]。由此可知接种1剂活疫苗17年，抗体持久性及免疫记忆良好，无需进行加强免疫。

之后，我国首个甲肝灭活疫苗（孩尔来福）也开展了多个临床试验与上市后临床研究，显示了疫苗良好的安全性与有效性[34-35]。近期的一项队列研究，将400名甲肝易感儿童按3∶1比例随机分为2组，分别接种2剂TZ-84株灭活疫苗或葛兰素史克公司灭活疫苗，随访11年后，2组甲型肝炎抗体阳性率均为100%，GMT分别为166.2和117.1 mIU/mL。模型预测，以GMT的95%CI的下限大于20 mIU/mL为标准，TZ-84株灭活疫苗抗体至少可以维持30年[36]。

三、我国甲型肝炎疫苗的应用成效

受益于甲型肝炎疫苗的成功研发和普及应用，甲型肝炎流行在我国得到了很好的控制。1993年全国病毒性肝炎流行率调查显示，全国抗-HAV IgG流行率为80.5%，城市儿童在10岁累积感染率达到50%，农村地区更是在3岁即达50%，属于典型的高流行区[37]。2000—2005年间，我国整体上甲型肝炎的流行模式完成了从高流行区到低流行区的转换[38-39]，年发病率从1992年的56/10万下降到2020年的1.07/10万[40-41]。流行模式的这一快速转换得益于我国经济的飞速发展与国家的疫苗免疫政策：一方面20世纪90年代以来，国内生产总值（GDP）从1992年的4 269.1亿美元上升到2020年的15.6万亿美元，我国人民居住条件、卫生条件及生活水平有了很大提高，甲型肝炎、细菌性痢疾等与卫生条件密切相关的肠道传染病发病率急剧下降[42]；另一方面，20世纪90年代初与2000年前后，甲型肝炎减毒活疫苗与灭活疫苗在我国相继研制成功，随即在青少年及儿童中大规模推广应用。2008年，我国更是将甲型肝炎疫苗纳入儿童扩大免疫规划（EPI）项目，对1岁半儿童实行免费接种。至2014年，我国5岁以下儿童甲型肝炎疫苗接种率达到91.7%，血清抗-HAV阳性率达88.1%；5~9岁儿童接种率也达到81.6%，血清抗-HAV阳性率达76.6%[43]。既往浙江椒江疫苗普种研究结果表明，随着疫苗累积接种率在15岁以下儿童中达到90%以上，甲型肝炎年发病率从1990年刚引入疫苗时的77/10万下降到1999年的0；同时，15岁以上人群（未免疫）的年发病率亦从49.6/10万下降到1.2/10万，显示了疫苗免疫消除人群甲型肝炎流行的可能与可及性[44]。相信伴随我国经济水平持续提高，党和政府的高度重视，甲型肝炎疫苗将更广地普及应用，必将更好地为国民健康保驾护航。

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