扫描电镜在观察溃疡性结肠炎果蝇肠道超微结构中的应用研究

2021-04-17王林燕

分析仪器 2021年2期

王博车畅关旸王林燕

(1.浙江中医药大学中医药科学院，杭州 310053；2.中国计量大学生命科学学院，杭州 310018)

溃疡性结肠炎作为临床常见的慢性特异性肠道炎症，近年来发病率急剧上升，其病因至今仍不明确，可能是由环境及遗传等因素相互作用形成。其病理特征主要包括肠道黏膜及下层出现炎症反应等[1]。外界环境中多种致炎因子会诱发肠炎，其中葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)是一种哺乳动物溃疡性结肠炎模型构建的常用药物，其诱导结肠炎的机制可能与T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等激活后引起细胞因子表达改变，导致肠上皮屏障破坏有关[2]。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)作为模式生物，肠道结构相对简单，其细胞炎症的发生过程及其分子机理与哺乳动物类似，且果蝇成虫肠道包含同人肠道相似的细胞类型及细胞组成。因此通过果蝇研究溃疡性结肠炎与肠道超微结构的变化具有重要意义[3,4]。

扫描电镜常用于观察生物组织三维立体像，但在生物组织亚显微镜结构研究中应用较少。例如在观察肠道微绒毛、上皮细胞细胞器等方面需要透射电镜[5]。随着扫描电镜分辨率的提高，通过扫描电镜背散射模式对肠道切片成像，可以得到类似透射电镜效果的图像且具有成像范围广、易于获取与收集切片等优势。基于此，本研究通过扫描电镜对果蝇肠道超微结构进行观察，探究DSS诱导的溃疡性结肠炎果蝇肠道超微结构的变化。

1 实验部分

1.1 仪器

场发射扫描电镜(日立，型号，SU8010)，超薄切片机(莱卡，型号，EMUC7)

1.2 试剂

戊二醛(Alfa Aesar)；四氧化锇(TED PELLA. INC)；Spon 812环氧树脂(SPI CHEM)；柠檬酸铅(SPI CHEM)；醋酸双氧铀(TED PELLA. INC)。

1.3 实验动物

黑腹果蝇：野生型 Oregon R品系，饲养在标准玉米糊培养基中(水76 g，琼脂1.5 g,糖13.5 g，玉米粉10 g，酵母粉0.7 g，丙酸0.5 mL)。培养温度25℃，相对湿度60%。

1.4 溃疡性结肠炎模型的建立

选取羽化3～5天果蝇成虫，转移至培养管中饲喂3%DSS和5 %蔗糖混合溶液，处理3天；对照组仅用5%的蔗糖溶液进行饲喂。

1.5 扫描电镜样品制备与观察

1.5.1 取材及固定

在预冷的PBS中解剖果蝇中肠在光学显微镜观察，另取中肠放置在2.5%戊二醛4℃过夜固定。PBS洗脱5min×4次；1%四氧化锇室温下固定1h，PBS洗脱5 min×4次。

1.5.2 脱水、包埋和聚合

加入不同浓度梯度(50%，70%，90%，100%)的乙醇室温下均处理10 min；丙酮室温下处理20 min，丙酮与Spon 812树脂(1:1和1:3)混合，室温下分别处理1 h和3 h。100% Spon 812树脂4℃过夜处理，样品转移至包埋板中加入100% Spon 812树脂60℃热聚合24 h。

1.5.3 切片、染色和观察

切取样品超薄切片(100 nm)转移至硅片上。经1%的醋酸双氧铀染色1 h，ddH2O漂洗后，滴加1%的柠檬酸铅染色15 min并漂洗。将硅片放置在场发射扫描电镜内进行观察。拍照参数为：加速电压2 kV，收集HA-BSE电子信号，并将得到的图片进行黑白反相。

2 结果

2.1 果蝇肠道解剖及光镜观察

图1(A和B)分别为正常组和肠炎组果蝇中肠光学显微镜图片。两组肠道均结构完整，无肠道壁破损或增厚现象，肠道内无黑色素瘤积累以及肠道增生等现象。

图1 果蝇肠道光学显微镜图A.对照组；B. 肠炎组

2.2 DSS对中肠上皮细胞的影响

扫描电镜观察结果表明两组肠道超微结构具有部分差异。图2(a-c)和图2(d-f)分别为正常组和肠炎组肠道超微结构图。其中图2a和图2d为低放大倍数(600倍)总览图，可清晰分辨肠道壁、肠道内腔以及腔内物质。进一步对肠道壁放大，可观察到肠上皮细胞及肠道微绒毛(图2b和图2e)，其中正常组肠道微绒毛排列整齐、密集且绒毛较长，而肠

图2 DSS对肠上皮细胞的影响a、b、c为对照组，bar=20μm, bar=4μm和bar=2μm；d、e、f为肠炎组，bar=20μm, bar=4μm和bar=2μm

炎组部分区域肠道微绒毛变短、稀疏甚至出现脱落。对肠道上皮细胞进一步放大可观察到正常组上皮细胞内包含大量线粒体，线粒体脊致密完整(图2c)，肠上皮细胞间存在紧密连接结构；相反肠炎组上皮细胞内膜结构较差(图2f)。

2.3 DSS对果蝇肠道细胞组成和微生物的影响

在正常组中，观察到位于肠上皮细胞之间的肠分泌细胞，该类细胞表面同样具有类似微绒毛的结构，内部存在囊泡(图3a)；在肠炎组中没有发现分泌细胞。另外在肠炎组中，观察到多个分布于肠道壁肌层的肠道干细胞，它们具有细胞核大及细胞质少的特点(图3c)。

肠腔内容物存在大量微生物，根据形态特征可以辨认包括真菌和细菌(球菌和杆菌)。其中肠炎组中肠道微生物密度高于对照组(图3b和图3d)。

图3 DSS对肠道细胞组成及微生物的影响a, b为对照组，bar=6 μm和bar=8 μm；c, d为肠炎组，bar=8 μm和bar=8 μm

3 讨论

随着显微成像技术的不断发展，现代病理学研究逐步从组织水平深入到细胞乃至亚细胞水平。尤其是扫描电镜分辨率的大幅提升，使得通过采集生物切片背散射电子信号，继而对超微结构的研究成为可能。背散射电子成像的衬度主要由样品原子序数的高低决定。原子序数越大获得的背散射电子越多，接收到信号则越强，图像越亮。然而生物组织和细胞的结构成分主要为轻元素，由于原子序数较小，对电子束排斥能力低，因而对电子散射的能力就小，显示出的超微结构也极其模糊。当对样品重金属(锇、铀和铅等)染色后，它们能与组织和细胞的不同结构成分进行不同程度的结合，从而使这些结构散射电子的能力不同，以增强明暗之比从而呈现清晰的超微结构。其中背散射电子多的结构在图像中表现出“浅亮”特征，背散射电子少的结构表现出“深暗”特征，为了使扫描电镜得到的灰度图在阅片习惯上与透射电镜相同，后续对采集的图片还需黑白反相[6]。

肠道超微结构的观察对于探究肠道疾病病因、发生发展机制和形态功能变化尤为重要。，本研究在果蝇溃疡性结肠炎组别中观察到肠微绒毛脱落，胞质内线粒体脊及膜性结构溶解等现象，这与哺乳动物(如大鼠等)溃疡性结肠炎具有相同病理特征[7,8]。

过去曾有研究表明，当对esg-Gal4,UAS-GFP/Cyo品系果蝇(该品系中肠干细胞具有GFP自发荧光的表达)饲喂适量浓度的DSS后，在荧光显微下可观察到果蝇中肠干细胞数量激增[9]。在本研究中发现肠炎组在肠道上皮细胞下层出现多个中肠干细胞，它们具有细胞核大，细胞质和细胞器少等干细胞具有的超微结构特征(图3c)，因此进一步证实DSS能刺激中肠干细胞数量激增。中肠干细胞分裂可用于补充肠道上皮细胞和肠分泌细胞等，从而参与肠道组织的修复[10]。因此推断DSS处理会对肠道细胞造成损伤，中肠干细胞参与肠道组织的修复[11]。

果蝇中肠组成除包括上皮细胞和干细胞外，另包含少量肠分泌细胞[3]。肠分泌细胞表面具有化学感受器，通过感知肠道内环境中各种物质的变化做出适当反应，例如释放激素到血液中[12]。结果显示肠分泌细胞内部具有多个囊泡，可能用于包装激素进行分泌。此外在分泌细胞表面观察到类似绒毛的结构，可能包含化学感受器用于识别肠道内环境(图3a)。而在肠炎组中，经多次切片均为发现肠分泌细胞，推测DSS可能对分泌细胞造成破坏。

肠炎组肠道微生物(包括酵母菌、杆菌和球菌)密度远高于对照组。由于两组之间的培养基均相同，因此推断肠炎组包含大量酵母菌是由于酵母在果蝇肠道内大量繁殖引起，即DSS处理促进了酵母菌的繁殖。过去有研究表明肠道微生物能够影响宿主动物代谢功能和免疫功能。如益生菌中的乳酸杆菌和双歧杆菌能够预防肠道感染性腹泻，甚至治疗肠炎[13,14]。而酵母作为具有活性的微生物，它不仅能够提供营养物质，还能和果蝇可能具有相互间的作用影响寄主的代谢反应[15]，例如酵母菌能缩短果蝇发育时间，增加繁殖力和寿命，促进对病原体的免疫反应。因此推断酵母菌大量繁殖可能用于提升肠道免疫应答反应用于消除肠道炎症对宿主造成的不利影响。对于肠道细菌而言，由于其种类繁多，通过电镜仅能辨别出球菌和杆菌，因此对于细菌和肠炎之间的关系还需进一步研究。