基质分散固相萃取-UPLC-MS/MS测定烟草中马来酰肼残留量

张海燕 陶晓秋 韶济民 靳冬梅 庞 夙 熊 巍

(四川省烟草质量监督检测站，成都 610041)

马来酰肼又名抑芽丹，是一种植物生长调节剂，烟草生产中常用其抑制烟草侧芽生长，国外应用比较广泛。由于其在烟草大田生长期的多次施用，从而会导致其在初烤烟叶中的残留, 烟叶中马来酰肼的残留会对吸烟者产生健康风险，国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)在2013年修订的烟草农药指导性残留限量名单[1]中，马来酰肼的指导限量为80 mg/kg。

烟草中马来酰肼残留量的分析方法主要有分光光度法(ISO4876-1980)[2]，高效液相色谱法(HPLC，YC/T405.5—2011)[3]、气相色谱法(GC)和胶束液相色谱(MLC)。烟草行业目前应用较为广泛的测定烟草中马来酰肼残留量的方法为HPLC-UV法(YC/T405.5—2011)，该方法对样品采用盐酸溶液加热回流萃取，用C18固相萃取小柱净化，HPLC-UV测定。该标准方法的检出限较高，且采用外标法定量，对烟草中低浓度马来酰肼残留量的检测准确度相对较低，容易出现假阳性检出现象。陈晓水[4]等建立了一种盐酸溶液加热回流萃取后经水相滤膜过滤，氘代同位素内标定量，LC-MS/MS法测定烟草中马来酰肼的方法，方法的检测灵敏度显著提高，但是分析时间为30 min，大量样品的检测会受到一定的限制。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC)[5-7]具有快速准确、灵敏度高等优点，适合于烟草样品中低残留量的马来酰肼的快速准确测定。

本实验采用加热回流法提取烟叶中的马来酰肼，分散固相萃取法净化样品，UPLC-MS/MS测定，氘代内标定量，适合于准确快速分析烟草中马来酰肼的残留量。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪(Xevo TQ，美国Waters公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；智能型加热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；涡旋振荡器(Vortex Mixer 230 V-EU 振荡器，美国Labnet 公司)； AE200 电子分析天平(感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo 公司)；Cascada ANMK2 纯水仪(美国Pall 公司)；0.45 μm 水相针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司)；单孔道移液器(20～200 μL)、电动分液器(德国Eppendorf 公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈(色谱纯，美国Thermo-Fisher公司)；马来酰肼标准品(化学纯度：≥98.5%，德国Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)，马来酰肼-d2标准品(化学纯度：98%，同位素纯度：98.9%德国Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)；N-丙基乙二胺(PSA)购自安捷伦公司(美国)，石墨化炭黑、弗罗里硅土，盐酸(分析纯，西陇科学股份有限公司)；甲酸(HPLC级，浓度为49～51%，德国Sigma公司)；水为超纯水。无农药残留烟叶样品由国家烟草质量监督检验中心提供。

1.3 标准溶液配制

标准溶液：称取10 mg马来酰肼标准品，精确至0.0001g, 用超纯水溶解并定容至10 mL，制得1.0 mg/mL标准储备液。取一定量的所述标准品储备液，用超纯水稀释定容，制得200 μg/mL标准工作液。

内标溶液：准确配置1.0 mg/mL马来酰肼-d2内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中。取一定量的所述内标储备液，用超纯水稀释定容，制得200 μg/mL内标工作液。所有的储备液和工作液于冰箱4℃保存，使用前将其恢复到室温。

1.4 样品的提取

称取5 g试样于圆底烧瓶中，精确至0.01g。加入50 mL 4 mol/L的盐酸提取液，250 μL氘代内标工作液(200 μg/mL)，适当振摇，使烟末分散与盐酸溶液混合均匀。将烧瓶放置于加热套中，装上球形冷凝管，将加热套温度设置为180℃左右，加热回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球处，回流稳定后开始计时，回流1小时。回流结束后，关闭加热套或油浴锅电源，冷却至室温。

1.5 分散固相萃取净化

移取1mL上清液于旋盖离心管，加入25 mgPSA吸附剂，漩涡振荡混合2 min，2000 r/m，吸取上清液经水相滤膜过滤，移取500μL滤液，并用超纯水稀释定容到1mL后待测。

1.6 LC-MS/MS条件

1.6.1 LC条件

色谱柱:Atiantis UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1mm，1.8 μm； Waters公司)；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液(v/v)， B为0.1%的甲酸乙腈溶液(v/v)；流速0.45 mL/ min；柱温45 ℃；进样量2 μL。梯度洗脱程序：0～2 min，100%A；2～2.8 min，100%A～30%A；2.8～3.0 min，30%A～20%A；3.0～4.0 min，20%A～5%A；4～6 min，5%A；6～6.1 min，5%A～100%A；6.1～8 min，100%A。

1.6.2 MS/MS条件

电喷雾离子源；正离子扫描模式；喷雾电压(IS)：3.0 kV；离子化温度500 ℃；雾化气流量：800 L/Hr; 锥孔气(cone)流量50 L/Hr; 碰撞气流量为0.15 ml/ min; 碰撞气为氩气，其余气体为氮气; 驻留时间为100 msec，正离子MRM模式采集。监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。

表1 多反应监测模式下马来酰肼及其氘代内标的部分质谱参数

2 结果

2. 1 标准曲线和检出限

为了减少基质效应带来的离子抑制或增强作用对定量分析的影响，采用空白样品提取液配制一系列基质标准工作溶液。分别移取标准工作液5 μL，12.5 μL，50 μL，125 μL，250 μL和500 μL标准工作液到7个10mL棕色容量瓶中，每个容量瓶移入25 μL内标工作液(200μg/mL)，配制成溶剂配制标准工作曲线。基质添加标准曲线的配制方法为分别移取500 μL每个标准工作曲线溶液于7个1.8mL旋盖色谱瓶，加入500 μL空白烟叶样品萃取液，用超纯水定容至1mL，马来酰肼的线性范围50 ng/mL-5000 ng/mL。分别对这些标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线。

以3倍信噪比确定方法的检出限，各种烟叶基质中马来酰肼的LOD范围为0.624～987 ng/mL，混合标准品及加标样品的总离子流色谱图见图1。

图1 1个晒烟样品的选择离子流色谱图

2.2 基质效应

基质效应一般是通过基质添加标准曲线和溶剂空白标准曲线的斜率来评价[8]。一般认为，ME值在85% ～115% 之间不存在基质效应。具体计算公式见式(1)。

ME= ( 1-X2 /X1 ) ×100%

(1)

其中，ME代表基质效应，X1 和X2 分别代表溶剂空白标准曲线和基质添加标准曲线的斜率。结果发现，烟叶基质对晒烟和烤烟中马来酰肼的基质效应分别为88.50%和88.47%( 根据表2 标准曲线数据计算)，可见烟叶基质对马来酰肼的响应强度产生了很大的抑制作用，但基质添加标准曲线仍可获得与溶剂空白标准曲线相似的线性响应( r2，见表2) 。因此本实验采用基质添加标准曲线对目标分析物进行定量，以避免基质效应对定量结果的影响。

表2 马来酰肼的标准曲线及线性关系

2.3 方法的回收率及重复性

选取不含马来酰肼的烤烟和晾晒烟叶样品，向不同类型的烟叶样品中添加标准溶液，分别按照“样品的提取和净化”的方法处理样品后上机检测，然后分别计算烤烟和晾晒烟样品中马来酰肼的回收率。每个水平测5次，得出平均回收率(表3)。如表3所示，马来酰肼平均回收率在105.9～111.8%之间，RSD范围为3.3%～9.1%。结果表明，方法的重复性和回收率均符合欧盟委员会[9]“食品和饲料中农残分析的质量控制和方法评价指导文件”的相关要求(回收率在70%～120%，重复测定RSD<20%)

表3 烟草中马来酰肼的回收率和精密度(n=5)

3 讨论

3. 1 色谱质谱条件的优化

采用流动注射方式进样进行母离子扫描，确定最大响应值的母离子，在子离子扫描(PI)模式下，调整CE找到该母离子对应的子离子，其中响应最高的锥孔电压和碰撞能量见表1。

马来酰肼在反相柱上有较好的保留行为，因此本实验选取了UPLC HSS T3，Hypercarb Porous Graphitic Carbon，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等色谱柱优化条件发现，采用UPLC HSS T3柱分离的峰性尖锐，对称，分离度明显优于其它色谱柱，能够将马来酰肼和基质中的干扰物完全分离，适合于不同类型的烟叶中马来酰肼残留量的测定。图1是1个马来酰肼有检出的晒烟样品的MRM色谱图。

本实验选取在水中加入甲酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)、乙酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)或者甲酸铵(5 mmol/L和10 mmol/L)作为流动相A进行优化色谱条件。结果表明，在水中添加0.1%的甲酸作为流动相A时分析物的质谱信号最强，峰形最好，所以最终选择0.1%甲酸水溶液作为流动相A。梯度洗脱程序仅需8 min，与标准方法(20 min)相比显著缩短了分析时间。

3.2 样品净化条件的优化：

分散固相萃取技术具有快速、高效和廉价等优点，被广泛运用于残留检测的前处理中。它主要通过非极性相互作用、极性相互作用、离子相互作用等选择性保留基质干扰成分，进而达到净化的效果[10]。常用的吸附剂材料有无水MgSO4、弗罗里硅土、PSA 和石墨化碳黑(GCB)。本实验考察了PSA、石墨化炭黑、弗罗里硅土几种净化剂对烟草中马来酰肼提取效率的影响。

由图2中结果可见，PSA对马来酰肼提取效率最高，因为PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团，主要作用力是极性相互作用及弱阴离子交换作用，可有效去除样品中的有机酸、脂肪酸和糖等干扰物，但对分子结构中带有羧基的化合物有一定的保留作用，所以本实验选用PSA作为前处理的净化剂。

图2 不同净化剂对烟草中马来酰肼的提取效率

3.3 实际烟叶样品检测与标准方法对比

利用该方法与标准方法(YC/T405.5-2011)同时对20个烟叶样品进行检测，并且对两种方法的检测结果进行相关性分析，如图3。

图3 UPLC/MS-MS法与标准方法检测马来酰肼残留量的相关性

由图3中相关性结果可以看出，本方法与标准方法检测烟叶中马来酰肼残留量的相关系数R2=0.9894，则r=0.9947(r0.01=0.561，n=20)。r> r0.01，表明两种分析结果达到了极显著的正相关，其趋势线的斜率为0.998，接近1，两种方法的测定值无显著差异，具有较好的一致性。

4 结论

建立了烟草中马来酰肼残留量的准确快速分析方法，采用基质分散固相萃取处理烟叶样品，氘代内标定量，UPLC-MS/MS分析检测，总分析时间为8 min，各种烟叶基质中马来酰肼的检出限范围为0.624～987 ng/mL，加标回收率为105.9%～111.8%，相对标准偏差为3.3%～9.1%。本实验田建立的方法具有针对性强，检测时间短和灵敏度高的特点，能够很好的应用于烟草中马来酰肼残留量的快速分析检测。