益生菌/益生元调节骨代谢机制的研究进展

程引 张治国

中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700

在整个生命周期中，骨骼为保持其结构和功能的完整性，需要不断地进行重建活动。在成年人的骨骼中，每年更换原有骨骼的5 %到10 %[1]。骨重建活动主要由主导骨吸收的破骨细胞(osteoclasts，OC)和主导骨形成的成骨细胞(osteoblasts，OB)介导，并受多种细胞因子、激素、生长因子和转录因子的调节[2-3]。各种因素直接或间接影响骨重建，导致骨吸收/骨形成失衡，是骨代谢相关疾病的典型特征。其中骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种代谢性骨骼疾病，以骨量降低、骨微观结构破坏、骨脆性增加，易发生骨折为特征，是骨吸收/骨形成失衡典型例子[4]。有研究[5]表明，年龄50岁及以上的人群，约有三分之一的女性和五分之一的男性会因骨质疏松症而发生骨折，尤其是髋部骨折具有高致残率和致死率[6]。随着人类微生物组学研究的不断深入，肠道微生物对于健康和疾病的影响成为热点，而肠道微生物与骨代谢的关系也受到越来越多研究者的关注[7-9]。

“微生物组”(microbiome)一词由诺贝尔奖获得者Josh Lederberg最先提出，是指微生物、微生物基因组以及它们在特定环境中的相互作用的集合[10]。肠道微生物(gut microbiota，GM)是人体中数量最多、种类最丰富和作用机制最复杂的微生物群，也是目前与机体疾病关联研究最多的微生物群。研究显示，GM与炎症性肠病[11]、结直肠癌[12]、肥胖[13]、糖尿病[14]、骨质疏松症[7-9]等相关，甚至可能成为抗菌素耐药基因的储存库[15]。Ohlsson等[16]提出“骨微生物学”(osteomicrobiology)概念，以强调二者密切的相互关系，认为GM可能通过改变全身及骨髓的免疫状态调节OC生成进而影响骨代谢，并指出GM可能成为治疗OP和预防骨折的一个新的治疗靶点。

既往关于GM影响骨代谢的动物实验主要基于三种模式，给予益生菌和/或益生元干预，使用广谱抗生素治疗，以及在无菌条件下培养[17]。益生菌被定义为在给予足够量时对健康有益的活性微生物[18]，而益生元是促进有益微生物生长和/或促进微生物代谢物质有益变化的不可消化的可发酵食品成分[19]。国内外多项研究论述了益生菌/益生元补充剂可通过改变肠道菌群状态影响骨代谢，且在多种益生菌菌株和不同疾病的实验动物模型中得到证实[20-22]。本文结合相关文献试从调节免疫功能、肠上皮屏障功能、短链脂肪酸代谢产物等几个方面阐述益生菌/益生元影响骨代谢的机制。

1 调节免疫功能

前人的研究证实，GM可在生理或疾病状态下通过CD4+T细胞等炎症细胞因子的表达来调节骨生成或骨量丢失，从而影响小鼠的骨量[23-24]。由于GM数量庞大、种类庞杂，对于其具体作用机制的阐述尚不充分，然而越来越多的研究证明益生菌/益生元可能是GM调节骨量的主要机制之一[25]。

Ohlsson等[26]从小鼠去卵巢前2周开始，给其饮用副乳杆菌DSM13434和副乳杆菌DSM13434、植物乳杆菌DSM-15312、DSM-15313的混合制剂，6周后发现这些益生菌均改变了小鼠的免疫状态，抑制了去卵巢(ovariectomized，OVX)诱导的骨吸收。Britton等[27]以12周龄的OVX小鼠为研究对象，发现罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)治疗能够抑制CD4+T淋巴细胞的增加和肿瘤坏死因子信号的分泌从而抑制OC的产生，阻止了OVX诱导的RANKL水平的增加，也降低了破骨细胞标志物TRAP5 mRNA水平。Collins等[28]使用Rag1基因敲除(缺乏成熟T和B淋巴细胞)小鼠进行实验，同样发现淋巴细胞在介导L.reuteri6475抑制骨量丢失中起着关键作用；用肠系膜淋巴结和CD3+T细胞进行的体外研究发现，L.reuteri6475以浓度依赖的方式增加IL-10和干扰素γ的表达；其分泌的因子还可增强MC3T3-E1成骨细胞中的转录因子Osterix的表达。T细胞各亚型都能够影响骨细胞，尤其是调节性T细胞(regulatory cells，Treg)和辅助性T细胞17(Th17细胞)，Treg细胞抑制OC生成，Th17细胞诱导OC生成，二者的动态平衡在人体内各种炎症条件下十分重要[29]。研究发现嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，LA)可升高OVX小鼠体内Treg细胞数量，降低Th17细胞数量，通过调节Treg-Th17细胞平衡增加骨量；此外，LA还可抑制促进骨吸收的细胞因子(IL-6、IL-17、RANKL、TNF-α)表达，并诱导抑制骨吸收的的细胞因子(IL-10和IFN-γ)表达，进而防止OVX导致的骨量丢失[30]。这些研究表明益生菌/益生元通过影响免疫功能或抑制骨吸收、或促进骨形成、或二者兼之，最终起到调节骨代谢，延缓OP发生发展的作用。

2 调节肠道上皮屏障功能

肠上皮屏障功能受损是GM介导继发性骨质疏松症及绝经后骨质疏松症发生的一个重要环节。肠上皮是宿主和肠道微生物之间的屏障，肠道通过细胞旁间隙控制肠腔和上皮黏膜下层之间的分子运输。在生理条件下，细胞旁间隙阻止半径大于1.5 nm的分子通过[31]。病理情况下，如OVX小鼠性激素缺乏可导致肠道缝隙连接蛋白(如Claudin 2、3和以及JAM3)等分子的转录水平降低，肠道通透性增加从而造成骨量丢失[32]。而相关研究发现益生菌/益生元在维持肠道屏障功能，预防骨质疏松症方面有着令人惊喜的效果。

Li等[21]的研究发现无菌(germ free，GF)小鼠性激素缺乏不会导致骨量丢失，说明了GM在介导骨量丢失中的重要作用。而常规喂养的去势小鼠被分别饲喂鼠乳糖李杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)和VSL#3TM后，可导致肠道通透性降低，延缓去卵巢引起的骨量丢失。另一项研究发现，普通小鼠经抗生素干预导致肠道微生态失衡，肠道通透性显著增加，引发骨小梁破坏和骨量丢失；经饲喂L.reuteri可降低抗生素治疗后厚壁菌/拟杆菌的比例，防止肠上皮屏障破坏，并减少股骨和椎骨小梁的骨量丢失[33]。益生菌/益生元除降低肠道通透性、改变肠道菌群比例外，还可通过其他通路调节肠上皮屏障功能，预防OP发生。如提高肠上皮细胞紧密连接相关分子水平[34]；调控肠上皮黏膜表观遗传及矿物质吸收信号通路[35]。

3 调节短链脂肪酸代谢

短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是由食物中不可消化的碳水化合物(主要是膳食纤维)经肠道细菌发酵而产生。现有研究表明，SCFAs通过多种作用机制影响骨代谢过程，如直接抑制OC分化[36]，通过Treg细胞促进OB分化[37]以及降低肠道pH值促进钙的吸收[38]等。肠道中SCFAs的类型和含量不仅取决于所摄取食物纤维的类型和肠道消化食物的持续时间，还取决于肠道微生物群的组成和活性，如乙酸由许多类型的细菌产生的，而丙酸和丁酸只由有限的几种细菌产生[39-40]。益生元/益生菌主要通过改变肠道微生物的菌群结构来调节SCFAs的含量和类型，从而影响骨代谢。

Tyagi等[41]给予常规饲养的10周龄雌性小鼠口服LGG 4周，发现补充LGG不仅改变肠腔内微生物多样性，还可增加梭状芽孢杆菌的比例，使小肠组织和血清中丁酸水平升高，骨形成标志物也随之增加。另一项研究表明，低聚果糖(fructo-oligosaccharide，FOS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)等益生元增加动物骨密度的机制主要是调节肠道中双歧杆菌的比例，从而提高SCFAs的含量以及有效成分的利用度[42]。Rodrigues等[43]的研究结果佐证了这一观点，FOS或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum，B.longum)喂养大鼠4周后，大鼠盲肠总厌氧菌数、盲肠重量、盲肠内及外周血丙酸浓度以及骨质量、骨强度均高于对照组。虽然补充不同种类的益生菌/益生元发酵后产生不同类型、不同浓度的SCFAs[44]，但其最终都可正向调节骨代谢，促进骨吸收/骨形成平衡，有效防治OP。

4 其他机制

既往诸多研究已证实，益生菌/益生元在矿物质代谢中起到重要作用。无论在生理或病理状态下，益生菌/益生元均可增强啮齿动物和人类的钙吸收[45]；菊粉提高骨矿质含量的作用在动物实验和临床研究中均得到了证实[46]；经FOS干预的胃切除大鼠钙吸收增加[47]；菊糖和果寡糖都可增加OVX大鼠的钙吸收[48]；雪莲果粉和长双歧杆菌喂养的大鼠胫骨钙、磷、镁含量显著高于对照组，从而起到预防OP的作用[43]。另外，研究发现长双歧杆菌可以通过上调SPARC和BMP-2基因的表达来促进成骨过程，增加骨密度[49]。

益生菌/益生元调节骨代谢机制见表1。

表1 益生菌/益生元调节骨代谢机制Table 1 The regulatory mechanism of probiotics and prebiotics in bone metabolism

5 展望

骨微生物学是指有关微生物和微生物群在健康和疾病中的作用以及微生物群调节出生后骨发育、骨老化和病理性骨量丢失的机制的调查[16]。肠道微生物作为人体最大的微生物群体，在既往研究中大多采用两类方法研究其对骨代谢的作用，①调节微生物数量(通过抗生素干预或使用无菌小鼠)；②调节微生物种类(通过添加益生元或益生菌)。由于肠道微生物群的个体间差异较大，益生菌的来源、数量、种类、功能也难以一致，且以往大多数研究都基于动物模型，若要设计进行规范、标准、成规模的临床研究具有一定难度。

本文从调节免疫功能、调节肠上皮屏障功能、调剂短链脂肪酸代谢等方面综述了益生菌/益生元影响骨代谢的机制。不难发现这些机制之间有一定关联，同一种益生菌可能发挥不同的功能，同一机制也可由不同的益生菌介导。在未来，除进一步发现筛选菌株和探索相关机制，多菌株的联合使用以实现调节骨代谢功能的优化应是一个研究方向。