中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌SDF-1含量影响的比较研究

杨铠宁 杨芳 邸贵鑫 林庶茹 陈晨

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症(osteoporosis，OP)以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，最终导致骨脆性增加并易于发生骨折[1]。隶属于中医学“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴。

相关研究表明，骨骼和肌肉的协调性可能与SDF-1的相关表达有关。本实验采用中医不同治法(补肾阴法、补肾阳法、健脾法、补肾健脾法)对绝经后骨质疏松症大鼠进行预防治疗，通过观察不同治法下，大鼠骨代谢生化指标血清ALP、TRACP及骨骼、肌肉中SDF-1的表达情况，以中医基础理论“脾肾相关”“骨肉不相亲”为指导，探讨骨骼和肌肉的协调性对绝经后骨质疏松症形成的影响，以求为中医防治骨质疏松症提供进一步依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Wistar雌性大鼠91只，SPF级，体质量(200±20)g，3月龄。从辽宁长生生物技术股份有限公司购入，实验动物质量合格证：211002300050643。饲养温度维持在24 ℃，相对湿度50 %，自由摄水。大鼠垫料和饲料从沈阳茂华生物科技有限公司购入，使用前均辐射消毒。

1.2 试剂与仪器

1.2.1主要试剂：Rat ALP ELISA kit批号：201911(AMEKO)；Rat TRACP ELISA kit批号：201911(AMEKO)；Rat SDF-1 ELISA kit批号：201911(AMEKO)。

1.2.2仪器：MR1822低温高速离心机(法国Jouan SA)；MM400高通量组织研磨机(Retsch)；INFINITE M200多功能酶标仪(瑞士TECAN)。

1.3 实验药物

补肾阴组采用左归丸，药物组成有熟地黄、山萸肉、山药、牛膝、枸杞、菟丝子、龟甲胶、鹿角胶；补肾阳组采用右归丸，有熟地黄、山萸肉、山药、杜仲、枸杞、菟丝子、当归、鹿角胶、制附子、肉桂；健脾组采用补中益气汤，由黄芪、人参、白术、炙甘草、当归、升麻、柴胡、陈皮、生姜、大枣组成；补肾健脾组中药由鹿角胶、熟地黄、淫羊藿、黄芪、党参、甘草组成；福善美组用药出自杭州默沙东制药有限公司。以上用药均购于辽宁中医药大学附属医院。

1.4 造模及分组

1.4.1造模：各组大鼠(正常组除外)给予10 %水合氯醛溶液(3 mL/kg)，实施肌肉注射麻醉，于腰背部脊柱旁做纵行切口，暴露两侧卵巢将其结扎切除，最后缝合各层切口。

1.4.2分组：术前先将实验大鼠随机分为正常组(10只)和手术组。术后除正常组外，将手术组的大鼠随机分为6组，即模型对照组(模型组)、补肾阴中药组(补肾阴组)、补肾阳中药组(补肾阳组)、健脾中药组(健脾组)、补肾健脾中药组(补肾健脾组)和福善美对照药组(福善美组)。

1.5 给药

术后第2天开始灌胃给药，每日1次，共计灌胃10周。大鼠胃容积为1 mL/100 g，以此为大鼠配药及灌胃。其中正常组、模型组灌胃给予0.9 %氯化钠溶液，补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组、福善美组均按成人每公斤体重所用生药量的6.3倍灌胃(成人体重按60 kg计算)；每周二早9:00称量大鼠体重，以此调整用药量。

1.6 取材及指标检测

实验大鼠经过相应药物防治10周，末次给药后，禁食不禁水24 h，进行标本采集。根据实验动物保护相关要求，每只大鼠称重后实施麻醉，以3 mL/kg注射10 %水合氯醛溶液。用碘伏将手术处擦拭消毒，开腹抽取腹主动脉血5～8 mL/只。取出右后肢股骨和左后肢腓肠肌白肌部分，放入高压灭菌的EP管内并予以标记，放入-70 ℃冰箱保存备用。将骨骼和肌肉分别放入约其体积量5倍的MSH 缓冲液中洗擦干净，称重后用剪刀剪碎放入匀浆管中，向每个管中加入小钢珠，用高通量组织研磨机以30 Hz研磨5 min。将腹主动脉血和匀浆后的骨骼和肌肉放入离心机，以3 000 r/min离心15 min，然后将离心后取得的上清液放入新的EP管中。各检测步骤按ELISA试剂盒说明书操作，检测各组大鼠血清ALP、TRACP及骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平，用EXCEL计算标准曲线的直线回归方程，以此计算各指标。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清ALP、TRACP水平

骨形成指标血清ALP测定：模型组大鼠血清ALP水平比正常组显著升高(P<0.01)；各治疗组大鼠血清ALP水平与模型组比均显著降低(P<0.01)，以福善美组降低最为明显，补肾健脾组次之，见表1。

骨吸收指标血清TRACP测定：与正常组相比，模型组大鼠血清TRACP水平显著升高(P<0.01)；而各治疗组大鼠血清TRACP水平均比模型组显著降低(P<0.01)，其中以福善美组降低最为明显，其次为补肾健脾组，见表1。

表1 各组大鼠血清ALP、TRACP水平的比较Table 1 Comparison of serum ALP and TRACP levels among rats in each

2.2 各组大鼠骨组织、骨骼肌SDF-1水平

检测结果显示：模型组大鼠的骨组织SDF-1水平比正常组显著升高(P<0.01)；与模型组相比，补肾阳组、福善美组大鼠骨组织SDF-1水平均显著降低(P<0.01)，健脾组、补肾阴组也明显降低(P<0.05)；补肾健脾组也有很大程度降低，但差异不具有统计学意义。

模型组大鼠的骨骼肌SDF-1水平比正常组显著升高(P<0.01)；与模型组相比，福善美组、健脾组大鼠的骨骼肌SDF-1水平显著降低(P<0.01)，其余治疗组也有所降低，但差异无统计学意义。

表2 各组大鼠骨组织、骨骼肌SDF-1水平的比较Table 2 Comparison of bone and skeletal muscle SDF-1 levels among rats in each

3 讨论

3.1 “脾肾相关”与骨痿“骨肉不相亲”

《素问·五运行大论》曰：“肾生骨髓。”肾藏精而精生髓，髓充于骨。肾精是否充足直接决定骨骼是否强壮，若肾精充盛则骨髓充盈，则表现为骨骼强健，壮实有力。《素问·五脏生成》：“脾之合肉也。”《素问·太阴阳明论》言：“今脾病不能为胃行其津液。四肢不得禀水谷气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉，皆无气以生，故不用焉。”脾主运化，脾作为后天之精的化生之脏，其健运如常可确保肌肉充分得到水谷精微的滋养，健壮有力。《素问·痿论》：“脾主身之肌肉，肾主身之骨髓。”肾属先天之本，脾乃后天之本，先天生后天，后天养先天，脾和肾的功能发挥相互影响。肾中阳气可以温煦助力脾之运化，脾运化的后天之精亦可滋养肾中先天之精。当后天水谷精微不足，无法充养肾精骨髓、生养肌肉，则致筋骨失养，肌肉骨骼痿弱不用。

《素问·五脏生成》曰:“肾之合骨也，其荣发也，其主脾也。”骨的生长发育除了受肾的直接影响，还与脾息息相关。《脾胃论·脾胃胜衰论》中有言：“大抵脾胃虚弱，阳气不能生长，是春夏之令不行，五脏之气不生。脾病则下流乘肾，……则骨乏无力，是为骨痿。令人骨髓空虚，足不能履地，是阴气重迭，此阴盛阳虚之症。”可见，脾虚也是骨质疏松症的发病关键。《灵枢·经脉》又言：“足少阴气绝，则骨枯。少阴者，冬脉也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，则肉不能着也；骨肉不相亲，则肉软却；肉软却，故齿长而垢，发无泽；发无泽者，骨先死。戊笃己死，土胜水也。”说明骨痿者骨不得肾气濡养，骨骼肌肉不相亲和，运动不相协调，可致肌肉痿软，甚至齿发枯槁无泽。这也是中医对骨骼与肌肉关系最早的概括。

3.2 SDF-1水平的变化对骨质疏松症影响

基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是最初由骨髓基质细胞分离出来的CXC类趋化蛋白，被命名为CXCL12。SDF-1的趋化作用由其受体CXCR4介导，SDF-1与CXCR4结合从而启动下游信号通路。实验表明，SDF-1在包括成骨细胞在内的多种细胞中存在，SDF-1/CXCR4轴可能参与白细胞浸润、炎症反应和器官发育等一系列重要的生理和病理过程[2]。

林剑彪等[3]发现轴向应力刺激，可以促进骨缺损区组织SDF-1α信号通路高表达，激活CXCR4信号，以此促进骨再生。虎嘉祥等[4]通过实验发现，SDF-1α通过与胫骨软骨下骨中的CXCR4结合来促进破骨细胞的形成，进而得出抑制SDF-1α/CXCR4信号通路能预防创伤后骨关节炎骨小梁丢失，还能减缓软骨退化的结论。Yang等[5]将91名绝经后骨质疏松症患者、88名绝经后非骨质疏松患者与90名健康女性作对比，发现绝经后骨质疏松患者血浆CXCL12水平显著升高。从以上实验不难看出，SDF-1/CXCR4信号通路的相关表达对骨骼的生长发育产生明显影响。由此可以推断，该通路可以作为骨质疏松症在中医领域病机研究的新方向。而本研究中，模型组大鼠骨组织和骨骼肌的SDF-1水平与正常组比较均显著升高，也恰恰说明去卵巢骨质疏松症大鼠的骨骼发育受到抑制。

3.3 中医不同治法治疗绝经后骨质疏松症的效果

本研究结果显示，模型组大鼠血清ALP和TRACP水平均比正常组显著升高，说明骨形成和骨吸收均处于较高水平，骨代谢增强，去卵巢致骨质疏松症大鼠造模成功；与模型组比较，各治疗组药物降低大鼠血清ALP和TRACP水平，抑制骨吸收，降低骨转换率，有效防治骨质疏松症，与以往研究结果一致[6-7]。

补肾阴法在绝经后骨质疏松症的研究中，如用六味地黄汤[8]、二至丸[9]等可有效提升去卵巢大鼠雌激素水平，减缓骨代谢失调；应用左归丸滋补肾阴者在基础和临床上也都取得了良好的疗效[10-11]。应用补肾阳法的研究，如右归丸[12]、温肾固疏方[13]等都能改善绝经后骨质疏松症的骨密度和相关通路的表达。以往也有研究将补肾阴法和补肾阳法治疗绝经后骨质疏松症的效果进行比较，二者均有疗效，但对比结果有所不同[14-16]。本研究结果显示，此二法均可降低骨骼和肌肉中SDF-1的水平，但补肾阳法对于降低SDF-1水平的效果上要优于补肾阴法，能更有效地防治绝经后骨质疏松症。后续研究也将对此结果加以佐证。健脾法的治疗经常与补肾法合用，运用补肾健脾方法对绝经后骨质疏松症的疗效甚好[17]。

本研究中的补肾二法采用能滋阴补肾、填精益髓的左归丸和温补肾阳、填精止遗的右归丸，均是张景岳的经典名方。健脾法使用李东垣的补中益气汤，具有补中益气、升阳举陷之功。补肾健脾法采用鹿角胶、熟地黄、淫羊藿、黄芪、党参、甘草等补肾健脾的中药。

结合以上研究和本研究结果，补肾阴法、补肾阳法、健脾法和补肾健脾法均可以通过降低骨骼和骨骼肌中SDF-1的水平促进二者再生和发育，增强肌肉收缩力，增加骨骼与肌肉的协调性，得以对绝经后骨质疏松症进行有效防治；也进一步印证了“脾肾相关”的中医基础理论在骨质疏松症治疗上的充分应用，“补肾为主，健脾为辅”，为中医临床治疗骨质疏松症提供科学的实验根据。