绝经后骨质疏松症差异表达lncRNAs及其靶基因抑瘤素M在外周血的表达研究

李生强 谢冰颖 陈娟 谢丽华 叶云金 黄景文 葛继荣

福建省中医药科学院骨质疏松证候基因组学研究室，福建 福州 350003

随着老龄社会的到来，骨骼健康逐渐引起人们的重视。骨质疏松症以骨骼脆弱和微结构退化为特点，主要出现在绝经后妇女，与椎体和非椎体骨折的风险增加密切相关。骨质疏松症导致的骨折是最常见的残疾原因之一，具有较高的致死率，给社会和家庭带来沉重的医疗负担。因此骨质疏松症的发病机制及防治研究具有重要的临床和公共卫生意义[1-2]。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于旧骨的清除(骨吸收)与新骨的产生(骨生成)之间平衡受到破坏，从而引起骨微结构破坏，造成骨量下降[2]。这种动态平衡受到许多因素的影响与调节等。长链非编码RNA(1ong noncoding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸且没有蛋白编码能力的转录本，大量证据表明，lncRNA参与了多种分子机制和疾病[3-4]。前期课题组以lncRNA-mRNA芯片技术为手段，比较分析PMOP患者与对照组外周血lncRNAs 表达谱变化，获得了差异表达lncRNAs[5]。本研究在lncRNA-mRNA共表达分析的基础上，分析差异表达lncRNAs及其靶基因的关系，预测lncRNAs二级结构，从临床纳入人群验证 lncRNAs及靶基因的表达变化，为从长链非编码RNA角度阐释骨质疏松症的机制提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究对象：从常住福州地区的汉族绝经后妇女中随机选择受试者，进行血常规、尿常规、肝功、肾功能、腹部B超和心电图等检查，结合问卷调查排除严重疾病者；采用双能 X 线骨密度仪检测受试者正位腰椎(L2-4)、左侧股骨颈、大转子和 Ward区骨密度(g/cm2)；根据骨密度检测结果，纳入骨质疏松症组及对照组各25例。

纳入标准：①骨质疏松症诊断标准参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)》[6]；②受试者均签署知情同意书。本研究方案获得福建省中医药研究院中医药临床研究伦理委员会审批通过[7]。

排除标准：①不符合中国人骨质疏松症诊断标准者；②类风湿性关节炎、糖尿病、甲状腺功能亢进等继发性骨质疏松症者；③合并有心脑血管、胃肠道等严重疾病者；④肝、肾功能检查异常者；⑤近 3个月内用激素替代治疗，使用降钙素者；近 6 个月内有连续 15 d 用双膦酸盐等防治骨质疏松症者[7]。

1.1.2主要仪器和试剂：Discovery W 双能 X 线骨密度仪(变异系数1.0 %，精度0.25 %，美国Hologic 公司)；微量核酸检测仪 Nanodrop ND-2000 (美国 Thermo scientific公司)；实时荧光定量 PCR 仪(7500 fast美国 ABI公司)；人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)；Trizol 试剂 (美国Invitrogen 公司)；引物合成、反转录试剂盒、SYBR定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1LncRNA 靶基因预测：在lncRNA-mRNA 共表达分析的基础上，利用blat工具对 lncRNA和mRNA(3'UTR)序列进行比对。序列相似的 lncRNA与mRNA(相关系数大于0.85且P值小于0.05)预测为具有靶向调节关系。

1.2.2LncRNA二级结构预测：打开RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)网址，分别输入lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1全长序列，分别对其二级结构进行预测分析。

1.2.3总RNA抽提及反转录：抗凝采血管采集受试者空腹外周血2 mL，逐滴加入到淋巴细胞分离液，1 500 r/min离心15 min，小心吸出中间白色细胞层，并用生理盐水重悬、离心；Trizol法抽提细胞中的总RNA；微量核酸检测仪检测吸光度值，分析RNA的纯度并计算浓度。采用两步法进行反转录，每个样品取1 μg总RNA用于反转录合成cDNA，并于-80 ℃保存。

1.2.4实时荧光定量PCR验证：定量PCR采用 20 μL反应体系：SYBR mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX dye II 0.4 μL，稀释10倍的cDNA 2 μL，dd H2O 6.8 μL；一个样品中的一个基因做3个重复孔；PCR反应步骤及相对表达量2-△△Ct法参照前期发表文献[7]。上下游引物序列及扩展产物大小见表1。

表1 定量PCR上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences for RT-PCR

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，计量资料采用均数±标准差描述。根据数据是否正态分布，选择非参数检验或t检验比较组间差异，以P<0.05 判断为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA 靶基因预测结果

LncRNA 靶基因预测结果见表2。

表2 LncRNA靶基因预测Table 2 Prediction of target genes of lncRNAs

2.2 LncRNA二级结构预测

由于碱基数较长，研究表明LncRNA能形成保守的二级结构，对于它们参与复杂的调控作用起着重要作用。RNAfold 软件进行 lncRNAs结构预测，结果表明，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1均含有多个茎环及多分枝内部环结构(见图 1)。lncRNA 系列越长，如linc-FAM126B-1包含更多的环形结构(图 1C)，其二级结构越复杂，可能参与更多的生物学功能。

注：1 A：lncRNA TTC28-AS1；1B：linc-IRF2BP2-1；1C：linc-FAM126B-1。图1 RNAfold 预测 lncRNAs MEF 二级结构图Fig.1 MEF secondary structure of lincRNAs predicted with RNAfold software

2.3 两组人群基础资料及骨密度比较

骨质疏松症组及对照组人群基础资料见表2，两组人群在年龄、初潮年龄、怀孕次数、绝经年龄及BMI指数等方面差异均无统计学意义，结果具有可比性。与对照组相比，骨质疏松症组在腰椎及Ward区骨密度显著下降(P值均小于0.05)，两组骨密度比较见表4。

表3 受试者基础资料比较Table 2 Comparison of basic data of the

表4 受试者骨密度比较Table 3 Comparison of bone mineral density of the g/cm2)

2.4 定量PCR检测抑瘤素M及lncRNAs在两组人群中的表达

定量PCR结果表明，OSM在骨质疏松症组人群外周血中表达显著降低，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1等在骨质疏松症组人群中表达水平显著降低，与对照组相比，差异具有统计学意义(P值均小于0.05)，见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05。图2 定量PCR检测基因表达水平Fig.2 Expression level of the genes detected with real-time PCR

3 讨论

随着测序技术的迅速发展，越来越多的基因组转录本得到研究，从而产生了大量的长链非编码(long chain non-coding RNA,lncRNA)。虽然科学家已经掌握了许多DNA调节元件(如增强子、启动子)的调控特点，但是，鉴定及功能性研究仍然是当前lncRNA研究的首要任务[8-9]。从2018年开始，日益增长的研究表明，lncRNA在骨代谢中起着重要作用，许多长链非编码RNA被发现参与多种骨代谢疾病的发生、发展及转归过程[10-13]。在骨质疏松症，长链非编码RNA主要参与了成骨细胞分化[14-16]、破骨细胞分化[17]及细胞信号通路激活[2,16]等调节过程，在骨生成与骨吸收动态平衡中起着重要调节作用。

本研究在获得绝经后骨质疏松症差异性lncRNA及mRNA的基础上[5]，进行lncRNA-mRNA共表达分析，利用blat 工具预测lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的靶基因可能为抑瘤素M(OSM)。目前国内尚没有OSM与骨代谢的相关报道，但在国外已有相关研究。OSM作为白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)家族成员，是具有调节基因活性、抑制肿瘤增殖等生物学活性的分泌性糖蛋白[18-19]。骨细胞、成骨细胞和巨噬细胞均能以旁分泌的形式产生OSM。研究表明，OSM既可促进成骨细胞成骨分化，又能间接促进破骨细胞生成，是具有双向调节作用独特细胞因子[20-22]。OSM与受体(oncostatin M,OSMR)结合后可启动下游的广泛的信号通路[22]。OSM基因敲除小鼠具有成骨细胞数量降低、骨小梁减少的特征，表明OSM具有促进成骨细胞分化的功能[23]；OSMR敲除小鼠实验表明OSM可能通过影响成骨细胞的RANKL (receptor activator of nuclear factor κB ligand)表达，负向调节破骨细胞功能[24]。本研究中，样品来自人的外周血，OSM在绝经后骨质疏松症组表达水平下降，这可能与吞噬细胞、破骨细胞分化能力相关，表明外周血OSM的表达与PMOP具有相关性。在前期六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症患者的临床试验中，课题组发现患者治疗3个月后，外周血OSM的表达具有上升趋势，表明OSM可能是六味地黄丸治疗POP的靶标之一[25]。

生物体内RNA较少单独存在，它们往往与具有特定功能的蛋白质特异性结合从而发挥生物学功能，特异性结合就要求RNA具有一定的结构特征。RNA的二级结构会影响到RNA的生物学功能[26]。通过在线预测RNAfold预测得到lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的二级结构，它们均具有多个茎环、多分枝内部环，系列最长的linc-FAM126B-1其结构也最复杂，具有最多的茎环结构，说明它可能参与更多的生物学功能。LncRNA二级结构预测结合LncRNA功能研究，对于预测具有某种功能的结构单元、寻找药物治疗靶标具有重要意义。

在前期芯片检测中，我们发现，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及OSM在绝经后骨质疏松症组表达均出现下调。本研究结果表明，与对照组相比，骨质疏松症组lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM表达水平均显著下降，与芯片检测结果一致。外周血lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM的表达下调，可能与绝经后骨质疏松症相关。

本文不足之处在于本研究中临床例数还偏少，LncRNAs与OSM的靶向调节关系还需要进一步的实验验证，我们也将开展lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1相关功能性实验。

综上所述，本实验结果证明lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1 及其靶基因 OSM 基因在绝经后骨质疏松症中表达显著下调，它们可能为绝经后骨质疏松症的重要关联基因。本文从调控 PMOP的关联长链非编码RNAs及其靶基因OSM 入手，为阐明 PMOP的分子机制提供新的研究思路。