丹参注射液对骨质疏松合并动脉粥样硬化症小鼠的作用研究

梅凡 涂艳虹

江汉大学附属医院 武汉市第六医院综合科，武汉 430015

目前，人口老龄化现象越发严重，老年性疾病也为全世界卫生保健系统带来了日益沉重的经济负担。研究报告显示，随着年龄的增长，骨质疏松症(osteoporosis，OP)和动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)两者的发病率逐渐升高[1-2]，而且绝经后的女性发病率更高[3]。对骨质疏松和动脉粥样硬化的发病机制进行探讨，发现二者间存在紧密联系，大多数作用于心血管的药物对骨质疏松也可产生正向作用，如他汀类降血脂药可以刺激骨形成[4-5]，对骨组织具有合成代谢作用。但目前临床上能增加骨密度、降低骨质疏松性骨折较为肯定的心血管药物仅他汀类降血脂药，其他药物还缺少大量的临床试验结果。

丹参是我国临床常用的传统中药，具有改善微循环、抗氧化、增大血流量等多种功效，其主要活性成分包括丹参酮、丹参素、丹酚酸等，能够有效预防和治疗动脉粥样硬化[6-7]。有研究发现，丹参的粗提取物可促进骨细胞增殖和分化[8-9]，还有着促进骨折愈合的作用[10]。本研究拟构建骨质疏松合并动脉粥样硬化动物模型，采用丹参注射液进行治疗，通过观察血脂变化、动脉形态学改变、骨代谢指标和骨结构的变化，评价丹参注射液对大鼠骨质疏松并发动脉粥样硬化症的防治作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

36只6周龄SPF级雌性未交配C57BL/6小鼠，体质量18～20 g，来源于三峡大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2018-0104。饲养条件控制温度在22～26 °C，湿度50 %～60 %。

1.2 主要仪器和试剂

丹参注射液购自正大青春宝制药有限公司(2019031109)；辛伐他汀片购自杭州默沙东制药有限公司(2019020110)；戊巴比妥钠购自Sigma Merck(P3761)；小鼠骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)Elisa kit、骨钙素(osteocalcin，OC)Elisa kit、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、抗酒石酸酸性磷酸酶5(TARTRate-resistant acid phosphatase5，TRAP5)购自Bioswamp(MU30270、MU30420、MU30430、MU30923)；伊红、中性树脂、苏木精购自Solarbio(E8090、G8590、G1140)；新型脱钙液(快脱)购自Servicebio(G1107)；二甲苯、碳酸锂、冰醋酸、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司(10023418、20022818、10000218、10009218)。

酶标仪购自Labsystems Multiskan MS(型号：352 型)；全自动生化分析仪购自迈瑞(型号：BS-420)；自动组织脱水机购自湖北康强(型号：TKD-TSF)；生物组织包埋机购自泰维科技(型号：TB-718D)；正置显微镜、石蜡切片机购自徕卡显微系统(型号：DM1000、RM2235)。

1.3 方法

1.3.1模型构建：参考陈昱等[12]和杨其波等[13]的方法，采用卵巢摘除并高脂饲料喂养构建骨质疏松合并动脉粥样硬化小鼠模型；适应性饲养7 d后，用1 %戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，腹部备皮，仰卧位固定，常规消毒后铺巾，沿下腹正中切开，打开腹膜，切除双侧卵巢，逐层缝合，关闭腹腔，待小鼠苏醒后放入饲养笼中。一次性给予维生素D3(60万U/kg)腹腔注射后，每日喂服高脂饲料20 g(含5 %白糖、81.3 %基础饲料、0.2 %丙基硫氧嘧啶、10 %猪油、3 %胆固醇、0.5 %胆酸钠)，喂服45 d。

1.3.2分组和给药：将小鼠随机分为6组：对照组、模型组、低剂量丹参组、中剂量丹参组、高剂量丹参组、辛伐他汀组，每组6只。对照组行假手术后标准饲料正常饲养；模型组自造模第30 d开始进行蒸馏水灌胃，连续15 d；低、中、高剂量丹参组造模第30 d开始分别给予0.5、3.0、8.0 mL/(kg·d)丹参注射液腹腔注射，连续15 d；辛伐他汀组自造模第30 d开始给予0.6 mg/(kg·d)辛伐他汀灌胃，连续15 d。给药结束后，断颈处死小鼠进行取材。

1.3.3病理学观察：取出小鼠左侧股骨组织及主动脉血管组织。将骨组织放入装有组织体积10倍左右的快脱脱钙液容器中，脱钙后，骨组织对半纵切，主动脉血管组织切取0.3 cm长度组织，脱水浸蜡包埋，经切片、展片、烤片等后进行常规HE染色，显微镜下观察拍照。

1.3.4Elisa血清检测：各组小鼠处死前行腹主动脉取血，全血静置2 h，于3 000 r/min下离心10 min，收集血清。严格按照试剂盒说明书步骤测定小鼠血清中BALP、OC、ox-LDL、TRAP5水平。

1.3.5生化血清检测：于4 °C解融血液标本后，采用全自动生化分析仪测定小鼠血清中三酰甘油(TRIGLyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein，HDL-C)水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对数据进行处理和单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义；使用Leica Application Suite图象系统采集样本相关部位的图象并进行分析。

2 结果

2.1 丹参注射液对小鼠左侧股骨组织和主动脉血管组织病理形态的影响

如图1所示，对照组小鼠左侧股骨骨小梁丰富均匀，排列整齐，呈现连续致密的网状结构；与对照组比较，模型组小鼠骨小梁明显减少，结构松散不规则，部分断裂，髓腔内脂滴增多；与模型组比较，丹参各剂量组和辛伐他汀组骨小梁数量增多，高剂量组和辛伐他汀骨小梁排列紧密，连续性和完整性较好，髓腔内脂滴减少。

图1 小鼠左侧股骨HE染色(100*)Fig.1 HE staining of the left femur in mice (100*)

如图2所示，对照组小鼠主动脉三层结构层次清晰，内膜光滑完整，中膜平滑肌细胞排列致密整齐；与对照组比较，模型组小鼠主动脉三层结构紊乱，内膜明显增厚，平滑肌细胞增殖，多处形成附壁斑块，泡沫细胞和脂质沉积并可见颗粒状钙化灶；与模型组比较，丹参各剂量组和辛伐他汀组小鼠主动脉病变均有不同程度减轻。

图2 小鼠主动脉HE染色(200*)Fig.2 HE staining of the aorta in mice (200*)

2.2 丹参注射液对小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平显著上升(P<0.01)；与模型组比较，低、中、高剂量丹参组小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平显著下降(P<0.01)且呈剂量依赖性。见图3。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图3 小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平Fig.3 The serum levels of BALP,OC,and TRAP5 in mice

2.3 丹参注射液对小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ox-LDL水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平显著上升，HDL-C水平显著下降(P<0.01)；与模型组比较，低、中、高剂量丹参组和辛伐他汀组小鼠血清中TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平显著下降，HDL-C水平显著上升(P<0.01)。见图4。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图4 小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ox-LDL水平Fig.4 The serum levels of TG,TC,LDL-C,HDL-C,and ox-LDL in mice

3 讨论

临床研究表明，骨质疏松与动脉粥样硬化密切相关，患有骨质疏松症老年人群也常伴有动脉粥样硬化[13]。他汀类药物能够促进骨形成，增加骨密度并减少骨折发生率，但也在一定程度上对骨髓基质干细胞产生不良影响[14-15]。丹参作为我国传统中药，不仅能有效预防和治疗动脉粥样硬化，对骨细胞增殖和分化也有一定促进作用。本研究构建骨质疏松并发动脉粥样硬化小鼠模型，发现模型组小鼠梁小骨明显减少并排列紊乱，脂滴增多，主动脉血管也出现明显的动脉粥样硬化病理改变，提示模型构建成功。而经丹参注射液治疗后，股骨组织和主动脉组织病变均有所减轻。

骨转换标志物又称骨代谢标志物，其变化反映体内骨代谢平衡的变化，因此常被用于评价骨折危险性以及治疗骨质疏松药物的疗效[16]。BLAP和OC都是骨形成的重要标志物，其中BALP由成骨细胞合成分泌，在临床上常用于评价体内成骨细胞的活性；OC由成熟的骨细胞和成骨细胞合成分泌，随着骨组织矿化及成骨细胞分化增加，OC也特异性增加[17-18]。血液中的TRAP来源于破骨细胞、巨噬细胞和血小板等，分为两种同工酶a和b，其中TRAP5b是骨吸收的主要标志物，能反映体内破骨细胞的活性[19]。在本研究中，模型组小鼠血清BALP、OC、TRAP5水平相较于对照组显著升高，骨转换率提高，经丹参注射液治疗后BALP、OC、TRAP5水平均明显降低且呈剂量依赖性，提示丹参注射液能有效抑制骨形成和骨吸收，使骨代谢趋于平衡状态。

血液中的TC、TG和血管壁脂质容易被自由基氧化导致脂质过氧化物沉积，引发动脉粥样硬化[20]。LDL-C参与胆固醇向肝外转运的过程，其水平过高会促进TC、TG沉积[21]，而HDL-C参与胆固醇的逆向转运，有利于减轻脂质负荷[22]。此外，在氧化应激作用下，LDL易被氧化成为ox-LDL，进一步激活平滑肌细胞、巨噬细胞和单核细胞的表面受体，引发一系列急性炎症反应，被认为是动脉粥样硬化的关键启动因素[23-25]。本研究中模型组小鼠TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平升高，HDL-C水平降低，提示动脉粥样硬化的发生，而丹参注射液可以明显逆转以上指标，降低血脂水平。这与张红珍等[26]探索补阳还五汤对动脉粥样硬化模型大鼠的影响结果一致。以上结果表明丹参注射液不仅能够降低骨质疏松小鼠的骨转换率，对动脉粥样硬化也有一定的治疗效果。

综上所述，丹参注射液可以通过促进骨代谢平衡和降低血脂水平，对小鼠骨质疏松合并动脉粥样硬化起到缓解作用。