海藻酸钙/枸杞多糖凝胶微球对小鼠骨质疏松的作用研究

钟诚 孙国栋 范全 杨东亮 梁伟乔 贾海升 李宇明

1.暨南大学附属江门中医院骨科,广东 江门 529000 2.暨南大学附属第一医院骨科,广东 广州 510632 3.中山大学附属江门医院骨科,广东 江门 529000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)为常见疾病之一，该病以骨量减少、骨组织微结构退化为主要特征，导致骨脆性增加的一种骨骼疾病[1]。近年来的临床研究已证实，OP需长期服用药物，单一药物利用率低。为此，我们将药物与生物材料复合使用，这些生物材料能稳定血药浓度、减少给药频率、提高效率，从而显著提高疗效。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBPs)已证实其具有多种作用并均可防治骨质疏松症[2-6]。由于海藻酸钙(calcium alginate，ALG-Ca)微球廉价易得、无毒，具有良好的生物相容性、降解性等优势，在药物缓释中受到极大的应用。本研究建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，通过ALG-Ca/LBPs凝胶微球干预治疗，观察小鼠骨代谢生化指标、骨微结构的影响，探讨其疗效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及材料：健康9周龄雌性C57BL/6 J小鼠，体重(18.2±1.2)g(广东省医学实验动物中心)，于暨南大学医学部实验动物房饲养；ALG-Ca凝胶微球、LBPs/ALG-Ca凝胶微球(暨南大学理工学院)；LBPs(西安开来生物工程有限公司，纯度>70 %)。

1.1.2主要实验设备：显微手术器械(中国上海手术器械厂)；手术显微镜(德国Leica DM651)；全自动生化分析仪(日本 Olympus AU2700)；通风柜(中国科艺普)；冷冻切片机(德国Leica CM1950)；KD-H烘片机(中国 Kedee)；解剖体式显微镜(德国Leica S6E)；荧光倒置显微镜(德国Leica DM1000)；普通光学显微镜(日本Olympus)；Micro-CT仪(比利时Skyscan)；电子称(美国Denver Instrument)；数码相机(日本Canon EOS600D)；高压直流电源(中国东文高压电源天津有限公司)；扫描电子显微镜(日本Mitachi TM3030)。

1.1.3主要实验试剂：明胶(美国Sigma)；三溴乙醇(中国Sigma)；叔戊醇(德国Sigma)；碱性磷酸酶(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；1型胶原羧基末端肽(ELISA)试剂盒(武汉云克隆科技有限公司)；海藻酸钠(SODIUM alginate，ALG-Na)(美国Sigma)；氯化钙(广州化学试剂厂)；无水乙醇(天津天大化学试剂厂)。

1.2 实验方法

1.2.1ALG-Ca凝胶微球、ALG-Ca/LBPs凝胶微球的制备：称取定量的ALG-Na固体、LBPs搅拌并溶解于离子水中，将混合液10 mL倒入50 mL的注射器中，针头采用21G平头针头。称取11.10 g的氯化钙(CaCl2)溶解于1 000 mL去离子水中，制成0.1 mol/mL的CaCl2水溶液。在注射器针头部位接上负载电压，针头为正极，通过微量注射泵以50 μL /min的速度缓慢推出溶液滴入到CaCl2水溶液凝胶化30 min，形成直径1 mm左右的微球。过滤分离，最后用滤纸吸去微球表面水分，得到ALG-Ca凝胶微球或ALG-Ca/LBPs凝胶微球(LBPs浓度为40 %)，凝胶微球的pH值为7.16。冷冻、干燥后备用。

1.2.2C57BL/6 J小鼠骨质疏松模型的制备：所有SPF级C57BL/6 J雌性小鼠喂养至12周龄，平均体重(20.3±1.9)g。所有手术器械高温消毒，按三溴乙醇混合物(13 μL /g)将小鼠完全麻醉后，选取背部手术区域予以备皮、消毒。于肋下1 cm切开皮肤，钝性分离肌肉及腹膜，明胶海绵止血，在肠系膜脂肪中找到卵巢，完整切除双侧输卵管及卵巢；假手术组只切除卵巢周围等同质量的脂肪组织。常规预防术口感染，放回饲养笼中，注意保暖，所有小鼠均在监视下苏醒。

1.2.3实验动物分组：将40只雌性C57BL/6 J小鼠随机数字表法分为5组，每组8只，所有给药方式均为灌胃(0.005 mL/g)，1次/d，药物干预时间为12周。假手术组(Sham)，给予双蒸水灌胃；模型组(OVX+PBS)，给予双蒸水灌胃；单纯ALG-Ca凝胶微球组(OVX+ALG-Ca)，给予浓度为37.5 mg/mL的ALG-Ca凝胶微球水溶液灌胃；单纯LBPs组(OVX+LBPs)，给予浓度为25 mg/mL的LBPs水溶液灌胃；ALG-Ca/LBPs凝胶微球组(OVX+ALG-Ca/LBPs)，给予浓度为62.5 mg/mL的ALG-Ca/LBPs凝胶微球水溶液灌。

1.3 评价指标及方法

1.3.1骨组织HE染色检测：小鼠处死后取左侧完整股骨，置于4 %的多聚甲醛中固定。对股骨脱钙及脱水处理，完成后将标本组织块置于溶化的石蜡中充分包埋并凝固成块，切片机切片，厚度约6 μm。用二甲苯脱蜡、水化，染色，封片，显微镜下观察骨组织结构变化。

1.3.2骨代谢相关血清生化指标测定：给药结束后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置，3 500 r/min离心5 min分离血清。按试剂盒说明书对小鼠血清骨钙素(BGP)、血清碱性磷酸酶(BALP)和1型胶原羧基末端肽(CTX-1)进行检测。

1.3.3骨形态计量学静态指标测定：取小鼠右侧股骨，去除周围肌肉等软组织，冷冻保存。Micro-CT仪扫描股骨远端，检测参数包括：骨体积分数(percent bone volume，BV/TV，%)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N，n/mm)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp，mm)和骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th，mm)。

1.4 统计学处理

实验数据结果采用SPSS 21.0统计软件进行处理，均行正态性、方差齐性检验，运用单因素方差分析法，组间两两比较采用SNK-q 检验，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

纳入雌性C57BL/6 J小鼠40只，B组因麻醉意外死亡1只，用备用小鼠补充。进入结果分析小鼠共40只。

2.2 ALG-Ca/LBPs凝胶微球形态观察

在扫描电镜下观察ALG-Ca/LBPs凝胶微球显示，LBPs滞留在ALG-Ca凝胶微球，微球外观球形度好，颗粒均匀，圆整度较高，见图1。

图1 海藻酸钙结构图Fig.1 The structure of calcium alginate

2.3 骨组织HE染色

光镜下观察发现，Sham组小鼠股骨干可见网状样骨小梁，排列规则有序、紧密，骨微结构完整。OVX+PBS、OVX+ALG-Ca组小鼠骨小梁变细、断裂严重、结构稀疏。OVX+LBPs组小鼠可见骨小梁着色淡、部分断裂、结构紊乱。OVX+ALG-Ca/LBPs组可见小鼠骨小梁增粗，排列基本呈现网状，部分区域间隙增大，骨微结构形态较OVX+PBS、OVX+ALG-Ca组明显改善，但与Sham组比较，骨微结构仍未恢复到正常，见图2。

图2 股骨病理形态学变化(HE，100*)Fig.2 Pathological changes of the femur (HE,100*)

2.4 骨代谢相关血清生化指标测定结果

OVX+PBS组血清BGP、BALP、CTX-1水平较其他组显著升高，证明骨质疏松模型制备成功。OVX+ALG-Ca与OVX+PBS组比较，BGP、BALP、CTX-1水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与OVX+PBS组相比，OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs组血清BGP、ALP、CTX-I水平均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，但以OVX+ALG-Ca/LBPs组更为显著(P<0.01)，见图3。

2.5 骨形态计量学静态指标

小鼠右股骨Micro-CT三维重建图可见，与Sham组相比，去势后OVX+PBS组小鼠骨微结构明显退化，骨小梁稀疏、变细，数量减少，骨小梁间距增大，骨密度明显下降；与OVX+PBS组相比，OVX+LBPs组小鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th参数均升高，Tb.Sp降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与OVX+PBS组相比，OVX+ALG-Ca/LBPs组BV/TV、Tb.N、Tb.Th参数均升高，Tb.Sp降低，差异具有明显统计学意义(P<0.01)，见图4、5。

注：OVX+PBS与Sham组比较，#P<0.05；除Sham外，所有组与OVX+PBS比较,*P<0.05、**P<0.01。图3 骨代谢相关血清生化指标Fig.3 Serum biochemical indicators related to bone metabolism

注：OVX+PBS与Sham组比较，#P<0.05；除Sham组外，所有组与OVX+PBS比较，*P<0.05、**P<0.01。图4 小鼠骨Micro-CT三维重建图Fig.4 The three-dimensional reconstruction of mouse bone with micro-CT

3 讨论

LBPs为枸杞的主要成分之一，多项研究表明LBPs含有抗骨质疏松、调节免疫力、延缓衰老等药理作用[8-11]。如今，骨质疏松症是威胁老年健康的常见疾病，临床上久服抗骨质疏松药物的不良反应不容忽视，比如胃肠道刺激问题和诱发潜在性恶性肿瘤等[12-13]。枸杞为上等的中药材，取之方便，毒副作用小，其独特药理作用在抗骨质疏松研究中的作用明确。研究表明，LBPs对成年去势雌性大鼠骨质疏松有明显的改善作用，其机制可能与提高成年去势雌性大鼠血清中的一氧化氮水平有关[2-3]。马进峰等[4]研究显示，LBPs可以有效降低骨质疏松大鼠骨胶原的代谢水平，抑制其骨代谢的高转换状态，从而对骨质疏松有一定调节作用。王小敏等[5]研究证明LBPs可以提高骨质疏松大鼠的骨密度及碱性磷酸酶活性，提升血钙水平，表示LBPs能够改善大鼠骨质疏松状态。也有研究显示服用枸杞叶及LBPs可以延缓去卵巢后的骨质丢失[6]。从文献中看出，LBPs防治骨质疏松有明确的效果，但研究都不是很深入，这正是需要我们进一步挖掘。

LBPs直接口服具有吸收快、利用率低等缺点。我们将LBPs与生物载体材料复合使用，不仅可以保护LBPs，而且可以延长LBPs在胃肠道吸收时间，提高LBPs吸收率。ALG-Na来源广泛，在药物的控缓释中已经有了广泛的应用，ALG-Na结构中的古罗糖醛酸(G单元)能与Mg、Al等多种二、三价金属离子形成螯合结构。本研究采用静电悬滴法，以LBPs为药物模型，将ALG-Na溶液通过微量注射泵滴加到钙离子溶液的凝固浴中，形成直径1 mm左右，具有良好的球形度和单分散性的ALG-Ca/LBPs凝胶微球。ALG-Ca凝胶微球具有生物相容性、可降解性等优点，而且还有抑制炎症、调节免疫力等功能[14-15]，在生物医药科研中显得尤为突出，ALG-Ca凝胶微球对LBPs充分包埋，延长胃肠道吸收药物的时间，稳定血药浓度，提高药物利用率。

摘除卵巢后的小鼠随着雌激素减少出现骨的形成与吸收失衡，骨微结构发生改变，从而造成骨质疏松。本实验采用检测骨代谢指标及骨微结构来推测ALG-Ca/LBPs对小鼠骨质疏松的疗效。骨的病理形态学和骨形态计量学静态是检测骨微结构的两个重要评价，是客观直接反映骨质疏松组织形态状况的指标。在骨组织HE染色中，OVX+PBS组小鼠摘除卵巢后，小鼠骨质丢失严重，骨微结构明显改变，从而表现出骨小梁变薄，连续性中断、间隙变大，出现骨质疏松状态，证明小鼠骨质疏松模型制备成功，而OVX+ALG-Ca/LBPs组与OVX+PBS比较，骨小梁明显增粗，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，这点在Micro-CT结果中也得到证实。小鼠股骨Micro-CT结果显示，OVX+PBS小鼠去势后骨微结构破坏，骨密度下降，骨小梁稀疏，数量减少，小梁骨间距增大，与OVX组相比，骨质疏松严重。OVX+LBPs组与OVX+PBS组小鼠比较，BV/TV、Tb.N、Tb.Th参数均升高，Tb.Sp降低，差异具有统计学意义，表明骨质疏松状态得到改善，其中OVX+ALG-Ca/LBPs组改善明显，说明ALG-Ca/LBPs凝胶微球提高LBPs生物利用率，从而改善骨组织的形态结构来防治骨质疏松。当发生骨质疏松时破骨细胞活性增强，成骨细胞活性减弱，造成骨代谢出现负平衡。BGP是一种可以直接可以反映骨形成与重建的一种蛋白，BALP是显示破骨细胞活性的良好指标，故骨质疏松下BGP及BALP的含量会显著升高。实验中OVX+PBS组的BGP及BALP均明显升高，反映小鼠处于骨代谢负平衡状态。与OVX+PBS组对比，OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs组BGP、BALP均有不同程度降低，提示LBPs可以抑制破骨细胞的活性，降低骨转化率，使骨形成、重建加强。CTX-1是成熟型胶原降解时产生的一部分产物，也是骨中唯一的胶原成分，常用来诊断代谢骨病及评价抗骨病药物的疗效。实验结果显示OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs均能降低小鼠的血清CTX-1水平，以OVX+ALG-Ca/LBPs组降低明显，说明ALG-Ca/LBPs凝胶微球能产生抑制骨吸收的效果，从而改善骨质疏松状态。其中ALG-Ca凝胶微球起到良好的药物载体作用，延缓药物在胃肠道的时间，稳定血药浓度，进而提高药效。

本研究发现，ALG-Ca/LBPs可以降低骨吸收指标，改善骨的微观结构、从而对去势小鼠骨质疏松起到防治作用。可惜实验中ALG-Ca/LBPs凝胶微球对于改善小鼠骨质疏松的具体机制尚不能完全明确，可能与LBPs抗氧化、免疫调节等有关，这也有待我们以后研究中进一步发现，但是ALG-Ca/LBPs凝胶微球在防治骨质疏松中或许是一个新突破点。