银杏叶提取物对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠心肌成纤维细胞生长抑制作用及其机制

胡方芳，易鲛隆，王顺，成荣，李伟，罗振华

1 贵州省人民医院，贵州贵阳550001；2 贵州医科大学附属医院

心肌纤维化（MF）是各种因素如高血压、冠心病、心肌病等所致心肌细胞缺血、缺氧及坏死，心肌成纤维细胞（CFb）异常增殖，胞外基质沉积的重塑过程，MF可导致心肌的硬度增加、顺应性降低、舒缩功能下降，是慢性心力衰竭、心源性猝死的影响因素之一［1］。同时，MF 还会使心电信号传导受阻，诱发心律失常。因此，研究具有改善MF 病变功能的药物对于改善心脏功能及预防慢性心力衰竭的发生具有重要意义。TGF-β1-samd/TAK1 信号通路是MF的关键信号通路［2-4］，其可通过MMP/TIMP 调节胶原蛋白的降解。另一方面，TGF-β1-samd/TAK1 信号通路还可以通过结缔组织生长因子（CTGF）和相关microRNA 调节胶原蛋白的合成。银杏叶提取物（GBE）是以银杏叶为原料，通过加工提取得到的有效成分。研究［5］发现，GBE 有清除自由基、抗氧化、改善血液流变学、抗血小板聚集和防治动脉粥样硬化等作用。同时研究［6］发现，经GBE 治疗后Ⅰ型糖尿病模型大鼠的心室心肌内血糖、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、TGF-β1 的表达水平均明显降低，推测GBE 可通过下调TGF-β1基因表达，减少Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原的合成，进而抑制Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠MF，改善心脏功能。2018 年 1 月—2019 年 6 月，我们观察了GBE对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠CFb的生长抑制作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 动物、GBE、试剂及仪器 清洁级雄性SD 大鼠，210～260 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，饲养于贵州医科大学清洁级实验动物房。培养环境温度、湿度均恒定。SD 雌鼠与雄鼠按照3∶1 的比例共圈饲养，取出生1～3 d的SD乳鼠作为实验用鼠。GBE 由中国药品生物制品鉴定所提供，其成分及含量符合国家药品纯度标准。Anti-Vimentin anti⁃body 购自美国 Proteintech 公司，Anti-Actin antibody、ALK5抑制剂SB-431542购自美国ImmunoWay公司，TGF-β1 购自美国 Pepro tech 公司，通用型二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司。CX23 光学显微镜、IX71 倒置显微镜购自日本OLYMPUS 公司，CFX Connect QPCR 仪、凝胶成像仪购自美国BioRAD 公司，核酸分析仪购自Thermo公司。

1.2 CFb 细胞提取、分组及GBE 给予 取出生1～3 d 的SD 乳鼠心脏［7］进行原代细胞的培养及传代培养，取2～3 代生长密度达到80%融合的CFb 分为 4 组，其中 TGF-β1 组加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液，低浓度 GBE 组加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液和2 μg/mL的GBE溶液，高浓度GBE组加入20 ng/mL的TGF-β1 溶液和 20 μg/mL 的 GBE 溶液，对照组加入等量含10%胎牛血清的DMEM。

1.3 各组细胞增殖率测算 采用MTT 比色法。取各组细胞，继续培养48 h，加入浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，继续培养4 h，吸净上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，使用酶标仪测定各孔波长为490 nm 处的光密度值（OD 值），计算各组细胞增殖率。各组细胞增殖率=各组OD 值/对照组OD值×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞结缔组织生长因子（CTGF）、氨基末端激酶（JNK）、P38 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法。取各组细胞，继续培养48 h 后，TRIzol 法提取 RNA，反转录成 cDNA，以 cDNA 为模板、以 β-Actin 为内参进行 PCR 扩增。PCR 反应条件：95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 5 s，40 个循环。引物序列如下：JNK 上游引物为5′-AA⁃CAGCTCGGAACACCTTGT-3′，下游引物为5′-GAT⁃GTACGGGTGCTGGAGAG-3′；CTGF 上游引物为 5′-AATGCTGT TGAGGAGTGGGTG-3′，下游引物为5′-ACAGGTCTTAGAACAGCCGC-3′；P38 上游引物为5′-ACCTAAAGCCCAGCAACCTC-3′，下游引物为5′-AGCCCACGGACCAAATATCC-3′。以2-ΔCt表示细胞中目的基因mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，各实验组间结果均数比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖率比较 TGF-β1 组、低浓度GBE 组、高浓度GBE 组、对照组细胞增殖率分别为124.1% ± 13.4%、106.1% ± 7.5%、83.5% ± 5.2%、100.0%，其中TGF-β1组与对照组、高浓度GBE组相比，P均＜0.05。

2.2 各组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA 相对表达量比较 各组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA相对表达量比较见表1。

3 讨论

急性心肌梗死（AMI）严重威胁人类健康，介入治疗和药物溶栓的应用极大降低了急性心肌梗死患者的死亡率，但其后期形成的心肌重塑可导致充血性心力衰竭、致死性心律失常等恶性转归，是造成恶性心律失常和猝死的主要病理原因，因此延缓或逆转心肌纤维化是防治心肌梗死后心肌重塑的关键。

表1 各组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA相对表达量比较（）

表1 各组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA相对表达量比较（）

注：与对照组相比，▲P＜0.05；与TGF-β1组相比，△P＜0.01。

组别TGF-β1组低浓度GBE组高浓度GBE组对照组P38 mRNA 1.40±0.04▲0.61± 0.23▲△0.63± 0.24▲△1.00±0.00 CTGF mRNA 1.42±0.08▲0.76±0.03 0.64± 0.06▲△1.00±0.02 JNK mRNA 1.28±0.07▲0.51±0.09 0.37±0.14▲△1.00±0.10

GBE 为传统中药银杏叶的主要效应活性物质，含有200 多种药用成分，主要活性成分是银杏黄酮和银杏内酯类化合物［8-9］。GBE 在降血脂、张扩血管、抗炎、抗过敏、清除自由基、保护心脑血管、降低血清胆固醇等方面发挥药效［10］，在改善心力衰竭、减轻脑梗死面积、营养糖尿病周围神经病变、降低肺动脉高压及肺纤维化等多种疾病治疗中起到广泛作用。研究［11-13］发现，GBE 能够对 AMI 继发心肌重塑具有显著的保护作用，并能够改善CFb 病变对继发心肌重构细胞外基质病变相关蛋白以及胶原蛋白表达水平产生影响，同时GBE 的活性与其对TGF-β1-samd/TAK1 信号通路的调控有关。TGF-β1 导致心脏纤维化的相关实验研究主要局限在TGF-β1-samd/TAK1 细胞上游信号通路，但对下游信号通路具体调控MF 的分子作用机制仍然研究得较少，与剂量是否有关目前也尚未报道。

在组织纤维化过程中，TGF-β1-samd/TAK1 细胞信号通路是已知最重要的通路之一。samd 作为信号通路的上游信号蛋白因子，在被TGF-β1 激活后，活化CTGF、P38-MAPK、JNK-MAPK 下游信号通路，从而引起乳鼠炎症因子增加、心脏肥厚、间质纤维化、严重的心功能不全、心肌凋亡甚至死亡。CT⁃GF 是近年来发现的一种新的致纤维化的因子，为TGF-β1 的下游效应因子，CTGF 可接受多种细胞因子刺激［14-16］，如RAS 系统、氧化应激、炎性因子等，其中TGF-β1是MF的重要刺激因子，TGF-β1能够刺激CTGF 表达上调，同时 CTGF 与 TGF-β1 结合后，能刺激samd 磷酸化，启动MF 过程，因此二者相互促进，共同参与促纤维化效应，CTGF 与TGF-β1 一同作用导致哺乳动物多数脏器如肾、肺、心脏等发生纤维化［17］。JNK 是 TGF-β1-samd/TAK1 通路下游信号因子，当JNK 被激活后，磷酸化Samd 2/3 信号转导至细胞核内，形成Samd 2/3、Samd 4、CBP、TF 复合物，介导Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白表达。同时，JNK 还可通过Rac1/MLK3/JNK/AP-1 通路介导Ⅰ型胶原蛋白表达。在AMI 体外模型中，加入JNK 抑制剂可显著减少心肌细胞的凋亡［18］。研究［19］表明，JNK 被激活可引起小鼠炎症因子增加、心肌细胞肥大、基质增生、心肌细胞死亡。CTGF 和JNK 间存在复杂的通路联系，UTSUGI 等［20］在肺纤维化病理机制研究中发现，TGF-β1-samd/TAK1 信号通路在激活 CTGF 时，JNK在介导CTGF 表达升高起到重要作用。P38-MAPK作为samd 下游的信号分子，是MAPK 信号通路的主要成员，参与了心肌组织纤维化的发生发展，在诱发纤维化过程发展中起着至关重要的作用。有研究表明，在TGF-β1 的信号传递过程中，对P38 基因的表达干预将会下调TGF-β1的活性，对组织纤维化的过程起到延缓作用。以上研究表明，抑制TGF-β1-samd/TAK1及下游信号因子通路可能成为降低AMI后大鼠MF 的新靶点。本研究结果显示，TGF-β1 组CTGF、JNK 及P38 mRNA 表达显著增加，经 GBE 治疗后三者均降低，且高剂量组减低明显，认为可能与GBE 的剂量有关，提示GBE 可能通过抑制TGF-β1-samd/TAK1下游信号通路活化，进而抑制CFb增殖，达到延缓心肌纤维化的作用。

综上所述，对于 TGF-β1 诱导增殖的 CFb，GBE对其增殖具有明显的生长抑制作用，且可能的机制是通过下调TGF-β1-samd/TAK1 信号通路中CTGF、JNK、P38 基因的表达。因此，提示GBE 对心肌纤维化的发展起到延缓作用。