鲍的遗传育种研究进展

游伟伟，骆 轩，柯才焕

(厦门大学海洋与地球学院，福建省海洋经济生物遗传育种重点实验室，福建 厦门 361102)

鲍自古被誉为海味珍品之冠，素有“一口鲍鱼一口金”之说，是一类符合现代营养需求的高蛋白、低脂肪的优质海产品.我国自然海区分布着10余个鲍种，杂色鲍(Haliotisdiversicolor)和皱纹盘鲍(H.discushannai)因其较好的商品规格和适宜的养殖周期成为主要经济鲍种.20世纪70年代杂色鲍和皱纹盘鲍的人工育苗技术相继取得成功，同时开展了养殖实验[1-2].80年代中期在我国北方开始皱纹盘鲍小规模商业化养殖，90年代早期福建和广东等南方沿海地区从台湾地区引进杂色鲍和陆基水泥池养殖技术，随后鲍的规模化养殖迅速发展[3].1999年，南方的杂色鲍开始遭受冬季爆发性死亡和苗期“脱板症”的严重危害，杂色鲍养殖陷入低谷[4-5].不过从2000年开始皱纹盘鲍被引入福建海域，浅海筏架式养殖模式逐渐成熟，养殖面积和养殖产量呈现爆发式增长，随后皱纹盘鲍成为我国南、北方养殖的主导种[3,6].2019年我国的鲍养殖产量达18.03万t，占世界养殖总产量的90%以上，其中福建省的鲍养殖产量为14.3万t，占全国鲍养殖产量的79.3%[7]，鲍因其较高的经济效益，已成为福建省产值第一的水产养殖种类.鲍鱼养殖产业的发展壮大带动了鲍鱼养殖器材、海藻养殖、配合饲料、加工和运输业等行业的快速发展，现已形成完整的产业链，创造了巨大的经济效益、社会效益和生态效益.

随着我国鲍养殖业的持续高速发展，鲍的遗传改良与生产要求之间的矛盾逐渐突出[3,6,8]：首先，养殖鲍种长期自繁自育导致近交严重，个体小型化、抗逆能力弱、生产性能低等问题日益凸显；其次，尽管皱纹盘鲍在南方驯化多年，但由于其自身生活习性的限制以及极端气候事件频发等原因，近几年皱纹盘鲍在福建地区夏季的养殖存活率偏低，给当地渔民造成严重损失，而这一没有显著病症的夏季高死亡现象有逐年增加之势，已成为当前困扰福建鲍鱼养殖产业发展的主要问题之一；最后，虽然中国是第一产鲍大国，但因无法培育出大规格鲍鱼，每年仍需花费大量外汇从国外购买大规格精品鲍.因此，培育高产、抗逆、优质的鲍新品种对于我国鲍养殖产业的升级与国际竞争力提升具有重要的现实意义.过去20多年，国内已培育出4个国家级水产新品种，有力地支撑了鲍产业的健康发展.在各级科技项目的支持下，厦门大学贝类遗传育种团队在鲍的遗传改良方面也取得显著成果，本文就相关研究进展进行综述.

1 鲍种质资源库的建立与遗传评估

种质资源是开展遗传改良工作的基石.在福建省科技厅与福建省海洋与渔业厅的支持下，本课题组建成“福建省特色水产品种种质资源保护利用与共享平台”和“福建省鲍鱼遗传育种中心”，为鲍种质资源的保存提供了重要的硬件支持.在充分调研世界各地鲍的地理分布和生物学特性的基础上，经过20余年的积累，本课题组目前已汇集并逐步完善鲍种质资源库，涉及杂色鲍[9]、皱纹盘鲍[10]、西氏鲍(H.sieboldii)[11]、绿鲍(H.fulgens)[12]等多个主养鲍种，育成具有速长[13]、耐温[14]、耐低氧[15]、抗病[16]、富含类胡萝卜素[17]等优异性状的一系列原创育种材料，为鲍新品种持续培育提供丰富而可靠的育种材料.

杂色鲍是海峡两岸共同的重要养殖鲍种，本课题组搜集获得中国三亚、汕头、平潭、香港、台湾以及韩国和日本等不同地区的杂色鲍群体，并通过齿舌结构扫描电镜观察、同工酶分析、线粒体16SrRNA基因片段比较、简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)标记的综合对比分析[9,18-20]，对杂色鲍进行了大范围、高覆盖的系统发育研究，明确了杂色鲍族群间存在分化，证实我国现有的野生杂色鲍可分为南、北两大族群，但并未达到亚种水平.该结论为结束杂色鲍命名的争议提供了证据，也为强杂交优势组合的选配提供了理论依据.

皱纹盘鲍是我国鲍养殖的主导种.针对目前养殖皱纹盘鲍种质混乱的产业现状，本课题组在我国沿海多个鲍主养区开展调查，利用微卫星标记技术对15个皱纹盘鲍养殖群体的遗传背景开展分析，探明了我国皱纹盘鲍养殖群体的种质现状.结果表明，经过多年驯化，皱纹盘鲍已出现一定的遗传分化，且遗传多样性呈下降趋势，有必要通过遗传改良的办法防止种质退化对产业造成的负面影响[10,21-22].

2 鲍抗逆性状的精准评测

贝类抗逆性状的精准评测一直是困扰抗逆品种培育的主要技术难题，本课题组建立了基于心率测定的鲍耐高温、低氧性状评测方法.与传统的半致死温度、临界热最大值等测定方法相比，本课题组通过计算阿氏拐点温度(Arrhenius breakpoint temperature，ABT)来评估鲍的耐温性能[14]，心率ABT的测定具有样品数需求量少、无损、可进行个体评测、准确性高等优势.升温速率、个体大小、驯化温度、性别及饥饿等因素对鲍心率测定准确度的影响研究结果表明，该测定方法只与暂养温度有关，确定20 ℃的暂养温度、1 ℃/10 min的升温速率、停止喂食后7 d进行测定为最佳方案.采用该技术对多个鲍种的温度耐受性进行测评，结果显示，皱纹盘鲍中国福建省养殖群体的耐高温性能最为优异，并显著高于中国山东省长岛野生群体，表明经过多代驯化，皱纹盘鲍的耐高温性能得到显著提升.在此基础上，本课题组对该测定装置和技术进行了优化，通过测定溶解氧拐点浓度，在贝类里建立了一套针对耐低氧性状的无损精准测评技术[15]，为后续耐低氧新品种的开发奠定了技术基础.

3 选择育种及遗传参数估算

选择育种是目前动植物新品种培育中最常用和行之有效的手段之一.本课题组以5个不同地理群体的杂色鲍选育系为材料，应用完全双列杂交和因子交配设计相结合的方法，开展了杂色鲍的数量性状遗传效应分析，解析了生长性状的遗传力、遗传相关、基因与环境互作等重要遗传参数，为鲍的选择育种研究提供理论依据[13,16,23-24].本课题组基于巢氏平衡设计得到杂色鲍壳长遗传力为0.15～0.37，养成期体质量遗传力为0.27～0.34，并在此基础上提出群体选育是杂色鲍生长性状选育的首选方法[23].此外，本课题组对不同遗传背景的杂色鲍群体进行歧化选择，证实针对遗传多样性高的杂色鲍群体开展选育可获得更大的遗传进展[13].遗传相关研究结果显示，全湿质量受壳长的直接影响最大，足肌肉重受壳宽的直接影响最大，并基于此建立了全湿质量和足肌肉质量与形态性状的多元回归方程[24].基于杂种优势和配合力分析结果，证实了杂色鲍生长性状的母本遗传效应和抗病性状的父本遗传效应，并用于指导育种选配和新品种培育[16].

4 鲍的杂交育种

杂交是防止品种退化及创制优良品种的有效办法，它分为远缘杂交和近缘杂交.远缘杂交是指亲缘关系在种间或种间以上的两个物种之间的杂交, 它可以把不同物种的基因组组合在一起, 使得杂交后代在表型和基因型方面发生显著变化；近缘杂交是指同种内的不同品系、不同品种的个体间的杂交, 使得杂交后代在表型和基因型方面发生一定程度的变化[25].贝类由于其移动性差、喜群居等生态特点，不同种群间具有较大的遗传差异，杂交后常能获得明显的杂种优势[26], 杂交育种也已成为国内外鲍遗传改良的重要途径[27].

4.1 “东优1号”杂色鲍新品种的培育

针对我国南方杂色鲍养殖高死亡率问题，本课题组于2003年从日本东京都大岛引进杂色鲍群体，并证实了杂色鲍日本群体的高存活率特性.随后，采用完全双列杂交的方式，利用杂色鲍日本群体、中国台湾群体与越南群体作为材料，进行群体间杂交，对杂交和自繁后代的生长和存活性能进行跟踪记录，通过杂种优势率的比较和配合力的估算，得到最优的杂交组合为中国台湾群体♀×日本群体♂组合[16,28].2009年，以连续选育四代具有快速生长性状的杂色鲍中国台湾选育群体作为母本，以连续选育四代具有高抗病性的杂色鲍日本东京都大岛选育群体作为父本，采用群体间杂交技术培育而成的“东优1号”杂色鲍获得国家水产新品种证书(品种登记号：GS-02-004-2009)，为福建省第一个国家级水产新品种.自2010年起，“东优1号”杂色鲍已在福建、广东、海南等地进行规模化推广养殖，养殖试验结果表明：“东优1号”杂色鲍抗病力强，养殖成活率较原有养殖种提高30%以上，增产效果显著.特别值得一提的是，作为海峡两岸共有的鲍鱼养殖种，新品种通过亲鲍和苗种输送的方式也已在台湾地区的新北市、宜兰县等杂色鲍主养区全面推广，新品种因其高抗病力优势而在台湾地区的杂色鲍养殖业界形成良好口碑，极大地推动了杂色鲍养殖产业在台湾地区的复苏[29].

4.2 “西盘鲍”新品种的培育

针对主养种皱纹盘鲍在福建海区养殖夏季高死亡率问题，本课题组于2003年在国内开展了西氏鲍引种以及西氏鲍与皱纹盘鲍的种间杂交实验.通过水温、精龄、卵龄、授精精子浓度对杂交受精率影响的系列研究，本课题组确定了最优杂交授精条件，并开发出一种西氏鲍与皱纹盘鲍的种间杂交制种技术[28]，海区养殖对比试验也表明，西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种在生长和存活方面较对照组有显著提高.2014年，以西氏鲍长崎选育系为母本，以皱纹盘鲍晋江选育系为父本，采用种间杂交技术培育而成的 “西盘鲍”获国家水产新品种证书(品种登记号：GS-02-008-2014).该品种的突出特征为高温适应性强[11,30]，养殖成活率较目前国内主养种提高20%以上.2015年起，“西盘鲍”已在福建及广东沿海的鲍鱼主养区进行推广应用，有效缓解了我国南方鲍养殖产业的夏季高死亡率问题，取得了显著的社会经济效益.

4.3 “绿盘鲍”新品种的培育

绿鲍原产于美国和墨西哥太平洋沿岸，具有个体大、对高温适应性强、营养丰富、肉质鲜美可口、经济价值高的特点.早在20世纪70年代末和80年代初，我国就开始进行绿鲍引种以及与皱纹盘鲍的种间杂交试验，但未见继代自繁和杂交成功的报道[31].本课题组于2007年分两批次从美国加州引进绿鲍并驯化繁育成功，随后采用选育结合杂交方法开展了皱纹盘鲍与绿鲍种间杂交研究.针对皱纹盘鲍与绿鲍的杂交受精率不稳定现象，本课题组分别从水温、盐度、pH值、卵子和精子排放时间以及精子浓度等多个因素进行优化，确定了绿鲍与皱纹盘鲍杂交授精的关键影响因素，并进一步总结出一套绿鲍与皱纹盘鲍的种间杂交制种技术.经过18个月养殖，皱纹盘鲍♀×绿鲍♂杂交种的体质量较皱纹盘鲍和绿鲍分别高出57.7%和73.6%，成活率较皱纹盘鲍和绿鲍分别提高19.0%和8.9%[12].2018年，以连续6代群体选育的皱纹盘鲍为母本，连续4代群体选育的绿鲍为父本，并采用种间杂交技术培育而成的“绿盘鲍”获国家水产新品种证书(GS-02-003-2018).与养殖皱纹盘鲍相比，“绿盘鲍”的生长速度提高50%以上，耐高温性能提高2 ℃，增产效果显著[32]，并能批量养成单只质量超250 g的大规格精品鲍.目前，该新品种已在国内鲍主养区进行应用推广.“绿盘鲍”的应用不仅打破了国内大规格精品鲍长期依赖进口野生鲍的局面，同时还创建了国内新的大规格精品鲍产业链，形成养殖鲍高端、中端和大众化三类产品合理搭配的新格局，从而推动鲍产业提质增效和转型升级.

上述3个鲍新品种的形貌及性状对比见图1和表1.

图1 3个鲍新品种照片Fig.1 The photos for the three new abalone varieties

表1 3个鲍新品种的性状比较

4.4 鲍杂种优势的遗传解析

杂种优势是指两种或以上不同遗传背景的品种、品系进行成功杂交后，杂交子代往往在生长、适应力、抗逆性、产量、品质等方面表现出优于双亲的现象.贝类被认为是研究杂种优势的优良模式生物[33]，本课题组采用远缘与近缘杂交培育的3个新品种为鲍杂种优势形成的遗传机制解析提供了重要的育种材料.

针对杂色鲍抗病性状的杂种优势现象，本课题组对“东优1号”杂色鲍及其双亲的血细胞吞噬能力、基础呼吸爆发水平和密度值以及与体液免疫密切相关的4种酶活力进行了比较，结果表明“东优1号”杂色鲍继承了杂色鲍日本群体较高的机体免疫力，血细胞吞噬能力、基础的呼吸爆发水平、3种酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶)活力显著高于杂色鲍中国台湾群体[16,34].采用双向电泳技术对杂色鲍中国台湾群体、日本群体和越南群体的足部肌肉蛋白进行研究，识别出30个参与肌肉收缩和调节、能量代谢和胁迫应答等生理功能的蛋白，表明不同地理群体的杂色鲍具有不同的运动能力和能量分配方式[35].在攻毒、热刺激等条件下，在杂色鲍日本群体、中国台湾群体、“东优1号”3个群体间共找到60多个与环境应激、病原菌胁迫等相关的关键蛋白，这些蛋白在各群体中的“基础表达量”和“应激表达量”均存在显著差异[36].

针对西盘鲍耐高温的种间杂种优势现象，进一步将西氏鲍、皱纹盘鲍及两亲本正反交F1代共4个群体分别置于低温(12 ℃)和高温(28 ℃)下进行持续7 d的短期胁迫，结果显示各免疫参数均能被高温显著影响，西盘鲍的免疫指标水平高于皱纹盘鲍，预示西盘鲍在胁迫温度下有着更强的耐热力和更高的免疫系统效率[30,37-38].进而阐明在应对温度骤变和病菌胁迫等不利环境时，热休克蛋白70(HSP70)、冷激结构与蛋白(CSDP)和Ferritin等基因的功能和表达模式.蛋白质组分析结果显示：杂交种与亲本存在镜像关系，在参与能量代谢的蛋白中，西盘鲍的表达量介于两亲本的表达量之间，参与胁迫应答的蛋白表达量在4种鲍间的表达模式不一致[39-40].

为进一步阐明杂交种绿盘鲍的生物学特性，本课题组从饵料转化率[41]、耐高温[41]、耐低氧[15]、免疫应答[42]以及营养品质[43]等方面对绿盘鲍和皱纹盘鲍进行了全面比较.结果显示：温度对两个群体的生长及饵料利用率性状影响非常显著，随着温度的升高，绿盘鲍生长的杂种优势逐渐体现.与皱纹盘鲍相比，绿盘鲍在高温低氧条件下具有更强的调节心率变化的能力，更能耐受极限低氧和高温胁迫.弧菌感染和免疫应答试验结果表明，在成体阶段绿盘鲍比皱纹盘鲍具有更强的弧菌耐受性.对全南方渡夏和“南北接力”两种养殖模式下绿盘鲍和皱纹盘鲍的营养品质进行了分析，结果显示，绿盘鲍在两种养殖方式下肥满度均显著高于皱纹盘鲍，皱纹盘鲍足肌边缘硬度更高，咀嚼性、黏性、内聚性和恢复性均高于绿盘鲍，表现出两种鲍在质构上的差异.

5 分子标记的开发和应用

本课题组在全基因组尺度海量开发了组学和分子标记资源，建立鲍高通量分子标记开发和利用平台[44-46].采用DNA池法和两步聚合酶链式反应(PCR)法，利用264对微卫星引物，筛选鉴别出一个可区别“东优1号”杂色鲍及其父、母本的微卫星标记.在西盘鲍的种质鉴定方面，微卫星引物Awb002能够清晰地扩增出片段，位点呈丰富多态性，利用这对引物可以迅速地将西氏鲍、皱纹盘鲍及其杂交子代区分开来[47-48].在绿盘鲍的种质鉴定方面，筛选获得两对特异性引物，并且只通过两步PCR方法，即可完成对皱纹盘鲍、绿鲍及其正反交子代的种质鉴定.针对杂色鲍黄壳色变异群体，采用集群分离分析和DNA池的方法，证实标记Hdi3-119的381 bp的特异等位基因与黄色壳色突变紧密连锁，并将该标记定位在杂色鲍整合图谱第一连锁群14.9 cM遗传距离的位置上[49].

在遗传连锁图谱构建和数量性状位点(QTL)定位方面，本课题组构建了杂色鲍第一张基于SSR分子标记的遗传连锁图谱，平均遗传间距4.6 cM，共定位到2个全质量和2个肌肉质量相关的QTL，这些QTL及分布在雌性图谱的连锁群3和雄性图谱的连锁群14及连锁群1上[50].此外还构建了包含92 160个克隆的杂色鲍细菌人工染色体(BAC)文库[51]，利用开发的3 717个SNP标记构建了杂色鲍的第二代高密度遗传图谱，平均遗传距离0.59 cM，共检测到15个与全质量、腹足质量、壳质量、壳宽、壳长和壳高等生长性状相关的QTL[52].

6 重要经济性状的遗传解析

针对生长、耐温、抗病、品质等多个经济性状，本课题组在杂色鲍、皱纹盘鲍、西氏鲍等多个鲍种中开展了遗传解析研究.在杂色鲍方面，筛选和克隆了一批与鲍的繁殖、生长、免疫、早期发育等重要性状形成相关的功能基因[53-56]，并阐明其调控性状的分子机制，获得了一批具有重要育种价值的分子标记，为下一步杂色鲍全基因组尺度的遗传育种和新品种培育奠定了基础.

鲍的可食部分主要是腹足肌肉，但关于鲍肌肉生长的调控机制研究还很匮乏.利用转录组、微小RNA(miRNA)组、蛋白组、生物信息学及分子生物学等技术，本课题组研究了影响皱纹盘鲍肌肉生长的关键基因和分子通路[57-59]；筛选获得了肌球蛋白重链(MyHC)、Myophilin、生长分化因子8(GDF8)、滑形态发生蛋白7(BMP7)、hdh-miR-1984、LNC-OO1310等一批在不同大小皱纹盘鲍肌肉中差异表达的基因，对差异表达的蛋白编码基因及差异表达长链非编码RNA(lncRNA)和miRNA的靶基因进行功能注释和通路分析，结果显示它们都集中参与了调控细胞代谢过程、调控生物过程、细胞生长等与生长调控有关的功能；同时主要富集在有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤生长因子β(TGF-β)信号通路和和胰岛素等信号通路上.此外，还发现BMP7基因和hdh-miR-1984存在靶向互作关系，且hdh-miR-1984或可通过抑制靶基因BMP7对皱纹盘鲍生长进行负向调控，推测皱纹盘鲍主要是通过TGF-β 信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节和胰岛素等信号通路对肌肉生长进行调控.

采用转录组技术对耐高温群体和高温敏感群体的遗传差异进行分析，结果表明：皱纹盘鲍高温敏感群体的转录组在热应激条件下的变化水平更为剧烈，在两个群体中，热应激后与对照组相比，差异最显著的基因都集中在内质网蛋白加工、核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体信号通路上[60].

针对西氏鲍的橙红色足肌性状，本课题组已开展了连续3代选育，橙红足肌比例达100%.采用高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术，在橙红色足肌鲍中分离鉴定出两种类胡萝卜素——玉米黄质和β-胡萝卜素，在西氏鲍橙红色足肌中，二者含量约是普通鲍的16.5倍和3.1倍[17].通过不同颜色足肌西氏鲍的转录组、代谢组和蛋白质组分析，本课题组获得一批与西氏鲍累积类胡萝卜素紧密相关的基因、蛋白及表达调控信息，确定细胞色素P450芳香化酶1A1(CYP1A1)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因在玉米黄质转运和累积过程中扮演着重要角色，可能是变异群体中玉米黄质大量累积的关键原因，并有望在鲍科动物里培育出首个富含类胡萝卜素的新品种[61].

7 展 望

经过20余年的研究，本课题组构建了较为齐全的鲍种质资源库，育成一系列具有优异性状的原创育种材料，并培育出3个国审鲍新品种.先前对鲍的遗传改良研究多针对生长性状，今后将重点关注抗性、品质等复杂性状，并开发针对此类性状的高效测定和评价新方法.之前对于鲍的育种技术手段还是以选育、杂交等常规技术为主，在鲍的全基因组序列信息陆续破译后，今后将重点突破基因组选择育种技术，并结合基因导入、基因组编辑、多倍体育种等技术，持续培育系列优质鲍新品种，同时建立良种规模化制种和育、繁、推一体化技术体系，从而有效提高我国鲍的良种覆盖率并实现产业提质增效，为鲍产业的可持续发展提供最为重要的种业支撑.