二甲双胍联合吉西他滨对胰腺癌细胞增殖、迁移及上皮间质转化的影响

王文婷，彭钊，邓祖亮，周轩，刘力

湘南学院附属医院，湖南郴州423000

胰腺癌是临床常见的一种消化系统恶性肿瘤，由于其起病隐匿，症状和体征不典型，确诊时往往已错过了根治性手术的最佳时机［1-2］。有研究报道，仅有20%的胰腺癌患者能够从根治性手术中获益，但其术后5 年生存率仍不足5%［3］。因此，探索胰腺癌有效的治疗策略一直是近年研究的热点。吉西他滨是一种嘧啶核苷类似物，是美国食品和药物管理局批准的一线抗肿瘤药物，可通过抑制核苷酸还原酶和DNA 聚合酶而发挥抗肿瘤作用。吉西他滨作为晚期胰腺癌的标准一线治疗药物在临床上已应用二十余年，但其化疗效果并不理想［1］。二甲双胍一直是糖尿病的一线治疗药物。近年研究发现，二甲双胍能够通过抑制有丝分裂继而抑制细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖；还可通过降低循环胰岛素水平，阻碍胰岛素/胰岛素样生长因子1 轴的促肿瘤作用［4-5］。因此，二甲双胍被认为是目前最有前途的肿瘤治疗佐剂。但二甲双胍能否使胰腺癌吉西他滨化疗获益尚不清楚。2020 年3 月—10 月，本研究探讨了二甲双胍联合吉西他滨对胰腺癌细胞增殖、迁移及上皮间质转化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌细胞株PANC-1（以下称PANC-1细胞），购自美国菌种保藏中心。吉西他滨、二甲双胍无菌粉末，纯度均＞95%，购自美国Sigma 公司。Multiskan FC 基本型酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；IX70-81FZ 型倒置相差显微镜，购自日本Olympus 公司。MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养与药物干预 将PANC-1 细胞接种于含10% FBS 和1%青链霉素的DMEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h。待细胞生长融合超过80%时，按1∶3 传代。取传2代以上、对数生长期、生长状态良好的PANC-1 细胞，接种于96 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长融合60%左右时，一部分加入适量二甲双胍，使二甲双胍终浓度分别为0、5、10、20、40 mmol/L，继续培养24 h；一部分加入适量吉西他滨，使吉西他滨终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L，继续培养24 h。

1.3 细胞增殖能力检测 采用MTT法。不同终浓度二甲双胍和吉西他滨干预24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加入DMSO 150 μL，慢慢震荡混匀，使结晶充分溶解。酶标仪于570 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，计算细胞增殖活性。细胞增殖活性=实验孔OD570值/对照孔OD570值×100%。每个浓度设6 个复孔，实验重复3 次，取平均值。以能够使细胞增殖活性降至50%左右时的二甲双胍和吉西他滨浓度进行后续实验。

1.4 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。取传2 代以上、对数生长期、生长状态良好的PANC-1细胞，接种于96孔板，随机分为正常对照组、二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组，然后置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长融合60%左右时，用10 μL 移液器吸头垂直于孔板制作“一”字划痕，PBS 冲洗去除不贴壁细胞，倒置相差显微镜下拍照，记录0 h 划痕宽度。然后二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组加入适量二甲双胍或（和）吉西他滨，正常对照组加入等量培养基，37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h，倒置相差显微镜下拍照，记录24 h 划痕宽度。根据公式计算细胞迁移率，细胞迁移率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.5 E-cadherin、Vimentin 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取传2 代以上、对数生长期、生长状态良好的PANC-1 细胞，接种于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长融合60%左右时，二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组加入适量二甲双胍或（和）吉西他滨，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，收集细胞，RIPA 裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量合格，可用于后续实验。然后加入上样缓冲液，水浴变性。取变性蛋白50 μg，SDS-PAGE 分离蛋白。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。取出PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加入E-cadherin、Vimentin、GAPDH 一抗（稀释比均为1∶1 000），孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释比为1∶3 000），室温孵育，增强型化学发光检测试剂盒化学发光，化学发光成像系统拍照，Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3 次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，结果比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni 校正法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍和吉西他滨对PANC-1 细胞增殖活性的影响 经0、5、10、20、40 mmol/L二甲双胍干预，PANC-1 细胞增殖活性分别为（100.0 ± 3.0）%、（90.5±10.3）%、（75.6±15.0）%、（46.3±16.9）%、（33.6±4.2）%，随着二甲双胍浓度升高，PANC-1细胞增殖活性逐渐降低，呈浓度依赖性（F=29.14，P＜0.01）。20 mmol/L 二甲双胍干预时，PANC-1 细胞增殖活性降至50%左右，故以20 mmol/L 二甲双胍进行后续实验。

经0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 吉西他滨干预，PANC-1 细胞增殖活性分别为（100.0 ± 7.5）%、（86.7 ± 9.1）%、（68.2 ± 8.6）%、（55.1 ± 7.0）%、（35.2±5.4）%，随着吉西他滨浓度升高，PANC-1细胞增殖活性逐渐降低，呈浓度依赖性（F=66.88，P＜0.01）。0.4 μmol/L 吉西他滨干预时，PANC-1 细胞增殖活性降至50%左右，故以0.4 μmol/L 吉西他滨进行后续实验。

2.2 各组细胞迁移能力比较 正常对照组、二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组细胞迁移率分别为（99.93 ± 1.09）%、（77.36 ± 6.32）%、（71.00 ±5.29）%、（37.82±2.55）%。二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组细胞迁移率均低于正常对照组，联合用药组细胞迁移率均低于二甲双胍组、吉西他滨组（P均＜0.05）。而二甲双胍组与吉西他滨组细胞迁移率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组E-cadherin、Vimentin 蛋白表达比较 见表1。

表1 各组E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较（±s）

表1 各组E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与二甲双胍组比较，#P＜0.05；与吉西他滨组比较，△P＜0.05。

Vimentin 组别E-cadherin 1.000±0.027 0.857±0.059*0.840±0.057*0.548±0.053*#△正常对照组二甲双胍组吉西他滨组联合用药组1.100±0.111 1.311±0.091*1.345±0.049*2.121±0.052*#△

3 讨论

胰腺癌是一种恶性程度非常高的消化系统恶性肿瘤，近年来其发病率在国内外均呈明显上升趋势。胰腺癌起病隐匿，症状和体征不典型，确诊时往往已错过了根治性手术的最佳时机［1-2］。临床研究证实，胰腺癌患者即使能够接受根治性手术，术后也必须接受辅助化疗，才能进一步提高生存期［6］。

吉西他滨是一种嘧啶核苷类似物，是目前治疗胰腺癌最常用的化疗药物［7］，不仅能缓解胰腺癌症状，提高患者生活质量，还能延长患者生存期。但吉西他滨作为治疗晚期胰腺癌的标准一线药物临床应用已有二十余年，在化疗过程中易产生获得性耐药，导致其化疗效果并不理想［1，8］。因此，提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性是提高其化疗效果的重要措施。

二甲双胍是2 型糖尿病的一线治疗药物。近年研究发现，二甲双胍能够显著抑制乳腺癌、肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤进展，具有显著地抗肿瘤作用。在人类各种肿瘤中，通常存在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路表达不平衡，该信号通路异常激活可导致细胞增殖和分化异常，从而引起肿瘤的发生、发展［9-10］。有研究报道，吉西他滨的耐药机制与PI3K 信号通路异常调节有关。YOSHIDA 等［11］研究报道，二甲双胍能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。越来越多证据表明，二甲双胍对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，并且联合其他化疗药物能够明显提高化疗效果，被认为是目前最有前途的肿瘤治疗佐剂［12-15］。由此推测，二甲双胍有可能提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性，但目前相关报道较少。

本研究结果发现，随着二甲双胍和吉西他滨浓度升高，PANC-1 细胞增殖活性逐渐降低，呈浓度依赖性，提示二甲双胍和吉西他滨对胰腺癌细胞增殖均具有一定抑制作用。本研究选择能够使胰腺癌细胞增殖活性降至50%左右时的二甲双胍和吉西他滨浓度进行后续实验，结果发现，二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组细胞迁移率均低于正常对照组，联合用药组细胞迁移率均低于二甲双胍组、吉西他滨组，而二甲双胍组与吉西他滨组细胞迁移率比较差异无统计学意义。结果提示二甲双胍能够提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。

肿瘤局部浸润、远处转移和化疗耐药是胰腺癌患者预后较差的主要原因，而这些原因均与上皮间质转化密切相关。上皮间质转化的主要特征是上皮标志物（如E-cadherin）丢失和间充质标志物（如Vimentin）增加。有研究报道，二甲双胍能够通过靶向癌相关成纤维细胞抑制上皮间质转化，从而抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移［16-17］。本研究结果发现，二甲双胍组、吉西他滨组、联合用药组E-cadherin、Vimentin 蛋白相对表达量均低于正常对照组，联合用药组E-cadherin、Vimentin 蛋白相对表达量均低于二甲双胍组、吉西他滨组；而二甲双胍组与吉西他滨组E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义。提示二甲双胍联合吉西他滨能够上调胰腺癌细胞E-cadherin 蛋白表达、下调Vimentin 蛋白表达，即二者联合可显著抑制胰腺癌细胞上皮间质转化。因此，在含有吉西他滨的化疗方案中加入一定剂量的二甲双胍可能是一种比较有前途的胰腺癌化疗策略。

综上所述，二甲双胍联合吉西他滨能够抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及上皮间质转化，提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。但二者联合的具体作用机制还需进一步探索。