脑血疏口服液对脑出血大鼠神经功能及CD36表达的影响

黄 幸，常静玲，刘长英，刘若凡，高永红，李晶娅，张根明

脑出血(intracerebralhemorrhage，ICH)指原发性脑血管破裂导致脑实质出血，是发病率仅次于缺血性卒中的高发病率脑卒中亚型，具有高病死率及高致残率的特点[1-3]。目前认为脑出血后形成的血肿压迫脑实质导致的继发性脑损伤是影响脑出血病人预后的主要原因[4]，脑出血后预防血肿扩大及促进血肿本身的清除仍然是脑出血治疗的研究重点。临床应用脑血疏口服液(国药准字20070059，国家中药保护品种)发现其对血肿吸收有促进作用[5]，有利于病人神经功能康复[6]。本研究观察脑出血急性期应用脑血疏口服液对脑出血模型大鼠神经功能的影响，观察脑血疏口服液对脑组织CD36蛋白表达的影响，为临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 无特定病原体动物(SPF)级健康雄性SD大鼠18只，体质量(270±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0011。本研究所用动物均饲养于北京中医药大学东直门医院实验动物中心。实验过程中各环节严格遵守实验动物管理规定。按随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和脑血疏组，每组6只。各组间大鼠体质量比较差异无统计学意义。

1.2 试剂与仪器 Ⅶ型胶原酶(美国 Sigma 公司)，脑血疏口服液(山东沃华医药科技股份有限公司生产，国药准字Z20070059)，CD36抗体(Abcam)；数字脑立体定位仪(AST)；微量注射泵(HARVARD)；恒温加热仪(HARVARD)；微量进样器10 μL(Hamilton)；自动脱水、包埋机、烤片机(武汉俊杰电子有限公司)；光学显微镜(日本Nikon Ci-S型)。

1.3 脑出血动物模型建立 采用Ⅶ型胶原酶以大鼠尾状核为目的注射点来制备大鼠脑出血模型[7]：大鼠术前禁食不禁水过夜，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉。剃去手术区域毛发，碘伏局部消毒，俯卧位固定于立体定向仪上，并在顶部行正中切口，充分暴露头骨，将立体定向仪调整至使大鼠前囟和后囟在同一平面。以前囟为原点，向右旁开3.0 mm，向前0.5 mm，进行颅骨钻孔。将微量注射器吸取盐水或胶原酶Ⅶ后固定于立体定向仪并作调整，沿钻孔缓慢进针，深度5.5 mm，注射Ⅶ型胶原酶(C0773)0.1 μL，5 min注射完毕，留针10 min后将针退出并应用骨蜡封闭颅骨钻孔，消毒手术区域并缝合皮肤。假手术组进针后不注射，留针10 min，缓慢退出注射器。回笼饲养，给予正常进食进水，室温控制在25 ℃左右。待大鼠完全清醒后进行神经功能缺损评分。参照改良的神经功能缺损评分标准(mNSS)[8-9]进行行为学评分，以评价脑出血模型是否造模成功，7分及以上为造模成功。

1.4 给药方法 造模成功后，各组灌胃给药，给药时长3 d。每组大鼠均每隔24 h 给药1 次。将临床常用量根据体表面积折算，脑血疏口服液按3.6 mL/kg 体质量给药，假手术组、模型组给予同等剂量的生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能评分 造模后1 d、2 d、3 d进行mNSS神经功能评定。

1.5.2 血肿周围脑组织病理学 观察4%多聚甲醛灌注取脑，以血肿为中心按冠状位切取血肿周围2 mm的脑组织固定，脱水、石蜡包埋、连续冠状切片，切片厚度为4 μm，常规苏木精-伊红染色法(HE)染色，经脱蜡、水化、苏木精-伊红染色、脱水、透明后封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.5.3 脑组织CD36表达量测定 灌注生理盐水及4%多聚甲醛各100 mL 后，断头取脑，4%多聚甲醛固定48 h，以针孔为中心，制作脑组织标本，常规脱水、透明、浸蜡包埋及切片、免疫组化染色后光学显微镜下照相。在高倍物镜下，每张切片中随机选取出血灶边缘相互不重叠的3个视野，计数高倍镜(400×)下CD36蛋白的阳性细胞数。

1.5.4 蛋白质印迹法(Western Blot)检测 分离出血肿周边2 mm脑组织，裂解后采用碧云天BCA测定蛋白浓度，进行电泳，转膜，分别利用一抗1% BSA封闭液稀释，4 ℃孵育过夜，然后TBST漂洗3次，加入封闭液稀释HRP标记二抗，稀释比例为1∶5 000，37 ℃孵育1 h。TBST 漂洗，将PVDF 膜浸泡于ECL显色液中反应数分钟，待荧光带明显后定影曝光。曝光结果使用Image J软件分析灰度值，将每个指标与内参GAPDH进行灰度值比较，计算出每个指标的相对灰度值，使用Graphpad prism软件进行绘图。

2 结 果

2.1 各组神经功能缺损评分比较 各组大鼠分别在脑出血术后1 d、2 d、3 d进行mNSS神经功能评分。结果显示，各组大鼠术后均出现神经功能缺陷症状，大多数表现为不同程度前肢屈曲，行走路径向左侧偏斜；在第2天和第3天脑血疏组mNSS评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。随着时间的变化，同组间评分比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。

表1 各组大鼠不同时点mNSS评分比较(±s) 单位：分

图1 脑血疏组与模型组mNSS评分比较

2.2 各组病理学形态 HE染色镜下观察假手术组脑组织排列规整、形态完整，细胞数量和结构正常。模型组出血灶与周围组织界限明显，血肿中心大片坏死，周围组织细胞排列不规则、疏松，细胞肿胀变性，核结构不清晰，细胞和血管周围间隙水肿。脑血疏组与模型组比较，血肿周围组织坏死面积减少，周围组织疏松减轻，神经细胞的细胞核结构较清晰。脑出血区组织疏松、坏死， 周围组织疏松、水肿， 部分神经细胞肿胀、变性。详见图2。

图2 脑出血后大鼠脑组织HE 染色结果(×400)

2.3 脑组织CD36表达的蛋白量 蛋白质印迹法(Western Blot)结果显示，脑血疏组CD36表达量高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，模型组的CD36表达量低于假手术组，提示脑血疏能够促进CD36的表达，促进血肿吸收。详见图3。

与假手术组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 各组免疫组化CD36阳性细胞数比较 CD36细胞核染成棕褐色为阳性表达，脑血疏组血肿周围有大量CD36表达，假手术组几乎未见阳性细胞，模型组可见少量的CD36细胞。详见图4。

图4 各组大鼠免疫组化结果(×400)

3 讨 论

脑出血作为具有高发病率、高致死率特点的脑卒中类型之一，严重影响病人的生命健康，我国脑卒中病人中有24%为脑出血[10]。目前，针对脑出血急性期的治疗策略仍以控制血压、控制血糖、脱水降颅压、应用神经保护剂等内科干预及微创手术治疗为主[11-12]。脑出血发病机制越来越复杂[13]，随着脑出血后血肿吸收机制研究的不断进展，针对血肿本身的清除逐渐成为脑出血急性期治疗的研究热点。

脑出血后脑组织受血肿降解产物刺激，产生多种信号通路及炎性因子对小胶质细胞/吞噬细胞进行正向或负向调控，诱导小胶质细胞/巨噬细胞吞噬受损凋亡的红细胞，以达到内源性清除血肿的目的[14]。CD36属B类清道夫受体，是分布于小胶质细胞、单核/巨噬细胞等细胞上的膜蛋白，在不同种类的细胞中均有表达[15]，可介导巨噬细胞吞噬脑出血后包括红细胞在内的受损、凋亡或衰老细胞[16]。CD36是M2型巨噬细胞的表型标志物[17]，CD36刺激可使小胶质细胞/巨噬细胞活化以及M2极化[18]。脑出血后，CD36的表达上调，小胶质细胞在血肿周围显著表达，提示CD36在脑出血后介导小胶质细胞内源性清除血肿中起到重要作用，上调CD36的表达可促进血肿吸收[19]。有国外研究在药物干预后第3天采用免疫组化测定的CD36表达情况[20]，且CD36在第3天表达最明显，3 d后CD36的表达呈现逐渐下降趋势[21]。

脑血疏口服液的主要成分为黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎。脑出血急性期中医学病理变化有瘀停脉外而脑髓受压、津行不畅而痰水形成、诸邪胶结并化毒伤脑[22]，风火痰水热毒诸邪均损害脑髓，急性期后也会形成精亏髓减、正虚邪藏的恢复期及后遗症期病机[23]。脑血疏口服液组方是基于“气为血之帅，血为气之母”的中医学理论为基础，覆盖了因痰浊、瘀血、热毒等病理因素而致脑髓受损、清窍蒙闭的病机特点，多种药物成分组合而成，具有益气、活血、化瘀的功效，适用于气虚血瘀所致中风以及出血性中风急性期、恢复早期病人。有临床研究证实脑血疏口服液可以促进脑出血病人的颅内血肿吸收，促进神经功能恢复[24]。相关药理学及临床前实验研究显示，该药具有促进吞噬细胞功能，可加速血肿吸收[25]，并有抑制大鼠神经元凋亡[26]等作用。但其促进血肿吸收及吞噬细胞功能的具体作用机制目前尚未完全阐明。

本研究采用Ⅶ型胶原酶以大鼠尾状核为目的注射点来制备大鼠脑出血模型，此模型操作简便、重复性好、血肿大小稳定，且适合用于评价药物对脑出血后的效果研究[27]，结果显示模型组及脑血疏组均出现神经功能缺损症状，且明显高于假手术组，表现为肢体瘫痪，活动减少。神经功能评分结果发现脑血疏组评分高于模型组，说明脑血疏口服液可改善大鼠的神经功能缺损情况。模型组与脑血疏组间不同时间点mNSS评分比较，差异有统计学意义，每组随着时间的变化，神经功能评分都有改善趋势，且脑血疏组改善程度较模型组大，说明脑血疏口服液可改善神经功能缺损症状。光镜下观察模型组血肿中心大片坏死，周围组织细胞排列不规则且疏松，细胞肿胀变性，核结构不清晰。Western Blot检测可见脑血疏组CD36表达量高于模型组；免疫组化可见模型组少量的CD36细胞，而脑血疏组血肿周围有大量CD36表达。说明脑出血后给予脑血疏口服液，可提高CD36细胞在血肿周围表达，促进吞噬细胞对血肿周围坏死组织的吞噬，减少血肿周围坏死组织面积，进而促进血肿吸收，促进改善神经功能的恢复。本研究选择观察3 d后，测定CD36表达及神经功能缺损，实验结果显示脑血疏组较模型组CD36表达明显，脑血疏组神经功能评分较模型组有改善，证明早期使用脑血疏口服液可改善神经功能缺损，其血肿的内源清除机制可能是更早调动了吞噬细胞对血红蛋白吞噬，因而促进血肿吸收，这也为今后临床上早期使用活血化瘀药物提供了一定的依据。

综上所述，脑血疏口服液能改善脑出血大鼠神经功能缺损，通过提高CD36在血肿周围组织中的表达以促进脑出血后脑组织的血肿清除，在脑出血后减少血肿方面具有明显作用，具体的调控机制有待于针对其具体作用靶点及信号通路进一步研究。