基于高效液相色谱指纹图谱和化学模式识别法评价不同采收期水冬瓜树皮药材质量

韩忠耀,曹 芳,江品良,李 燕,李仕外,唐文双,余跃生,张林甦

(黔南民族医学高等专科学校,都匀 558000)

水冬瓜叶、水冬瓜树皮、水冬瓜根皮均为民族药材,来源于山茱萸科植物有齿鞘柄木的不同部位。其中,水冬瓜树皮为有齿鞘柄木的干燥根皮[1],别名为大接骨丹树皮,具有抗炎镇痛活性[2]。目前研究对象主要集中在水冬瓜根皮上,研究内容主要关于化学成分分析[3-6]、工艺参数考察[7]、指纹图谱建立[8-9]、质量标准研究[10],及紫丁香苷、总黄酮、浸出物等含量测定[11-13]等。作为民族药材水冬瓜根皮的潜在替补药材,水冬瓜树皮的研究对于野生植物药资源的保护、开发与综合利用具有重要意义。由于指纹图谱技术在植物药材研究中的应用广泛且具有独特优势[14-16],本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立了水冬瓜树皮的指纹图谱,基于文献[9]进行了方法学考察,并结合相似度分析,主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLSDA)等化学模式识别法,对不同采收期的水冬瓜树皮的指纹图谱进行了综合评价,以期为不同采收期水冬瓜树皮药材综合开发利用奠定基础。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD);FA1004B 型电子天平;Sartorius BT25S型电子天平;101-3AB 型烘箱;HH 系列数显恒温水浴锅。

对照品溶液:取适量紫丁香苷对照品,用甲醇超声溶解后,转移至棕色容量瓶中,用甲醇将其稀释配制成0.164 8 g·L－1对照品溶液。

紫丁香苷对照品,20 mg· 支－1,批 号为 161214;乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器工作条件

Agela Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温35 ℃;检测波长210 nm;进样量5μL;流量1.0 mL·min－1;流动相:A 为乙腈,B为0.5%(体积分数,下同)磷酸溶液。梯度洗脱程序:0～10 min时,B为91.0%;10～20 min时,B由91.0%降至85.6%;20～25 min 时,B 由85.6% 降 至82.0%;25～45 min 时,B 由82.0%降 至78.5%;45～60 min 时,B 由78.5% 降 至30.0%;60～70 min时,B由30.0%升至91.0%。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集及筛选

水冬瓜树皮均采自贵州省黔南布依族苗族自治州都匀市杉木湖沟渠,采集的药材经天津药物研究院有限公司鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木的树皮。依据当年有齿鞘柄木野外药材实际返青时间(4～12月)采集样本,在返青后的前期,每月采集样本1～3次;在返青后的后期,每月采集样本1～2次。

构建HPLC 指纹图谱后,与其他批次样品相比,返青初期(4月初)样本的相似度较低,故对构建HPLC的树皮样品进行了重新筛选,最终确定样品采集信息。采集水冬瓜树皮样品的编号为S1～S11,生长环境为山坡、沟渠,黄壤土,伴生植物主要有芭茅、囊吾等;采集经度为107°30′52.33″E,纬度为26°15′46.16″N,海拔为807 m;采集时间分别为2017年 的4 月15 日、5 月10 日、5 月20 日、6 月15日、7月10日、7月20日、8月15日、9月15日、10月15日、11月15日和12月15日。

1.3.2 样品的测定

将新鲜剥下的水冬瓜树皮置于55 ℃烘箱中烘干,粉碎后过孔径为(250±9.9)μm 的四号药典筛。混匀后,称取0.5 g药材粉末于100 mL 圆底烧瓶中,加入甲醇50 mL,于90℃回流1 h。放冷后用定性滤纸过滤,滤液收集在50 mL容量瓶中。用甲醇定容,过0.45μm 微孔滤膜,滤液即为供试品溶液,供高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 仪器精密度试验

取S1水冬瓜树皮,按照试验方法对其进行测定,重复进样6次,记录6次色谱图中共有色谱峰峰面积和保留时间。以4号峰紫丁香苷的色谱峰为参比峰,计算得到的各共有峰对应的物质与紫丁香苷的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1.7%,各共有峰与紫丁香苷的相对峰面积的RSD均小于2.3%,说明仪器精密度良好。

2.1.2 方法重复性试验

取S1水冬瓜树皮,按照试验方法平行制备供试品溶液6份,按照仪器工作条件测定,记录色谱图中共有色谱峰峰面积和保留时间。以4号峰紫丁香苷的色谱峰为参比峰,计算得到的各共有峰对应的物质与紫丁香苷的相对保留时间的RSD 均小于1.4%,各共有峰与紫丁香苷的相对峰面积的RSD均小于2.3%,表明该方法的重复性良好。

2.1.3 供试品溶液稳定性试验

取S1水冬瓜树皮,按照试验方法制备供试品溶液,分别放置0,2,6,12,24,36 h后进样测定,记录色谱图中共有色谱峰峰面积和保留时间。以4号峰紫丁香苷为参比峰,计算得到的各共有峰与紫丁香苷的相对保留时间的RSD 均小于1.7%,各共有峰与紫丁香苷的相对峰面积的RSD 均小于2.2%,表明供试品溶液在36 h内是稳定的。

2.2 指纹图谱的建立

按照试验方法制备S1～S11 水冬瓜树皮的供试品溶液,并按照仪器工作条件进样测定,将AIA格式色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》[国家药典委员会(GPC)2004 A 版],基于S6色谱图,以软件中的方法“中位数”生成对照指纹图谱(时间宽度为0.1 min),得到的11个批次样品的HPLC指纹图谱,紫丁香苷色谱图、对照指纹图谱及S1～S11的指纹图谱见图1。以共有峰4(对应紫丁香苷)为参比峰,计算18个共有峰与紫丁香苷的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示,18个共有峰的相对保留时间的RSD 均小于2.5%,而相对峰面积的RSD 在30%～124%内波动,说明不同采收期内水冬瓜树皮的18个共有峰对应的物质的含量差异较大。

2.3 相似度评价

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(国家药典委员会2004 A 版)中夹角余弦相似度方法计算各批次试样的指纹图谱、对照指纹图谱之间的相似度[17],结果见表2。

图1 紫丁香苷色谱图、对照指纹图谱和S1～S11的指纹图谱Fig.1 Chromatograms of syringin,control fingerprint and fingerprints of S1～S11

表2 对照指纹图谱及S1～S11试样的指纹图谱之间的相似度结果Tab.2 Results of similarity between control fingerprint and fingerprints of S1－S11

由表2可知:不同采收期水冬瓜树皮的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.932～0.982,表明不同采收期各批次药材的一致性相对较好,药材质量整体稳定、可控。

2.4 化学模式差异性评价

2.4.1 系统聚类分析结果

将18个共有峰的相对峰面积导入IBM SPSS Statistics 25统计学软件,采用组间均联法,以欧式平方距离为分类依据,进行系统聚类分析,11个批次药材聚类分析结果见图2。

由图2可知:当欧式平方距离为25时,可将11批次不同采收期水冬瓜树皮分为2类,其中除S10外的其他批次聚为第一类,记作第1组,S10单独聚为第二类,记作第2组。

2.4.2 PCA 和OPLS-DA 结果

图2 S1～S11系统聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis for S1～S11

基于文献[18-20],将18个共有峰相对峰面积作为变量导入SIMCA-P＋12.0化学计量学软件中进行自动拟合,以主成分1(峰2)为横坐标,以主成分2(峰3)为纵坐标绘制PCA 得分散点图,结果见图3。

图3 PCA 得分散点图Fig.3 Score scatter plot of PCA

由图3可知:S10偏离中心点最远,和其他批次存在显著性差异,这与系统聚类分析结果一致。

采用上述方法进行OPLS-DA 研究,以主成分1(峰2)为横坐标,以主成分2(峰3)为纵坐标,并根据图2系统聚类分析结果与图3 PCA 得分散点结果,将S1～S11分为2组,S10单独第2组,其他批次为第1组,绘制第1组与第2组的得分散点图,结果见图4。同时,采用变量投影重要性(VIP)准则进行统计筛选,以主成分共有峰峰号为横坐标,以VIP值为纵坐标绘制共有峰VIP图,结果见图4,其中,峰1数据在导入SIMCA-P＋12.0化学计量学软件时被自动筛除。

由图4可知:第1组与第2组的得分散点图结果和PCA、系统聚类分析结果一致,说明第1组与第2组区分效果较好;除峰1和峰4外,16个共有峰按照VIP值由大到小的顺序排序依次为峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2、峰10、峰3、峰18、峰9、峰14、峰12、峰13、峰17、峰15,其中,峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2等7个共有峰的VIP值大于1.0,峰10、峰3、峰18、峰9、峰14、峰12、峰13、峰17等8个共有峰VIP 值均大于0.9,峰15 VIP值大于0.8,说明不同批次水冬瓜树皮药材的质量存在微小差异,峰1～峰18可以用来衡量不同采收期内水冬瓜树皮二次代谢产物动态积累的差异,具有典型的代表性与构建的HPLC 指纹图谱共有峰的科学性。由于峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2(VIP值大于1.0)对不同采收期水冬瓜树皮的分类具有显著性影响,可将其对应的物质作为不同采收期水冬瓜树皮中主要化学成分变化的质量差异标志物。本工作还尝试采用液相色谱-质谱法鉴别这7种质量差异标记物的具体化学成分的归属,但由于该药材基础研究的缺乏,未能取得实质性的进展,需要进一步深入研究与探讨。

图4 第1组与第2组的得分散点图、各共有峰VIP值Fig.4 Score scatter plot of group 1 and group 2 and VIP values of common peaks

本工作基于高效液相色谱数据建立了水冬瓜树皮的指纹图谱,评价了不同采收期样品的相似度,采用系统聚类分析将采集的样本分为2组,采用PCA和OPLS-DA 验证了系统聚类的分析结果并给出了可以作为反映不同采收期水冬瓜树皮中主要化学成分变化的质量差异标志物。本方法可为水冬瓜树皮的质量控制及后期开发利用奠定基础,为民族药材的临床用药提供实际参考。