纳米流式检测技术的研发、应用及前景

吴丽娜，薛乘风，田 野，洪歆怡，章苗苗，颜晓梅

(厦门大学化学化工学院,谱学分析与仪器教育部重点实验室,福建省化学生物学重点实验室,福建 厦门 361005)

纳米颗粒无处不在，对细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)、病毒、细菌、亚细胞器等天然生物纳米颗粒和纳米药物、量子点等人工合成的功能性纳米颗粒的物理和生物化学性状在单颗粒水平进行快速的多参数综合表征，对于推动基础生命科学研究、生物医药和纳米科技的发展具有重要的意义.然而，纳米颗粒尺度微小且单个颗粒携载的功能分子数量有限，这使得单个纳米颗粒的多参数定量表征极具挑战性.2010年Science杂志发表述评指出：表征技术的匮乏已严重阻碍纳米医药的发展，纳米颗粒的表征是纳米医药面临的最大挑战[1].纳米颗粒具有高度的异质性和多样性，而动态光散射、排阻色谱等常规的体相分析方法只能够揭示纳米颗粒各项参数的平均水平，掩盖了颗粒间的个体差异.因此，发展具有高灵敏度、高通量和多参数检测功能的单颗粒分析技术，对揭示纳米颗粒的异质性、实现对纳米颗粒的各种属性进行关联分析具有十分重要的意义.相较于众多单颗粒分析技术，如电子显微镜[2]、荧光显微镜[3]、原子力显微镜[4]和表面等离子共振显微镜[5]，流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种对悬液中的单个细胞或微米级的颗粒进行快速、多参数定量分析的先进技术，具有统计精确性高和实用性强等优点.

然而，传统的商品化流式细胞仪是为细胞检测而设计的，其散射和荧光检测灵敏度均难以满足纳米颗粒(粒径<100 nm)的单颗粒水平表征的需求.如果能大幅度提升传统流式细胞仪的检测灵敏度，纳米颗粒的检测将具有FCM的快速、多参数、定量、天然状态悬液检测等优势.结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术，本课题组成功研发出具有自主知识产权的纳米流式检测技术(nano-flow cytometry,nFCM)，在国际上首次实现了发光能力低于单分子荧光的单个纳米颗粒散射信号的直接检测，将EVs、病毒、SiO2纳米颗粒(silica nanoparticles,SiNPs)、纳米金的单颗粒检测下限分别推进到40，27，24和7 nm.如图1所示，nFCM覆盖了传统流式细胞仪200 nm以下的粒径检测盲区，这在基础生命科学研究、生物医药、纳米科技、食品安全、环境监测等领域具有重要的应用前景.本文主要综述nFCM在单个纳米颗粒(包括EVs、病毒、细菌、亚细胞器、纳米药物、量子点等)分析方面所取得的重要进展，并阐明nFCM的检测原理和应用前景.

PMT.光电倍增管；APD.雪崩式二极管单光子计数探测器.图1 nFCM的应用领域Fig.1 The application fields of nFCM

1 超灵敏流式检测技术研发的重要性

FCM是一种对单个细胞或细胞大小颗粒的理化特性进行快速多参数定量分析的技术[6-9].其工作原理是：悬液中的细胞或微粒经流体动力学聚焦后逐一通过激光探测区，所产生的前向角、侧向角散射以及多色荧光信号经分光系统分光后被检测系统同时检测.通过散射光信号可对细胞(颗粒)大小和颗粒度进行定性分析；结合特异的荧光探针，将样品的生物化学信息转换为荧光信号，可实现DNA、RNA、蛋白质含量、酶活性、离子浓度、pH值以及膜电位等物理和生物化学性状的多参数同时测定.而将散射和/或荧光信号与背景区分是实现上述功能的前提条件.

就散射而言，传统流式细胞仪的散射光检测下限通常为200～500 nm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)微球[10-11]，而且生物纳米颗粒的折射率较PS微球要小得多(PS微球为1.59，细菌为1.38～1.45[12]，病毒为1.45～1.46[13]，EVs为1.40[14]).根据米氏散射理论，直径为1 μm的细胞产生的前向散射光(forward-scattered light, FSC)强度与直径为0.4 μm的PS微球相当[15].而病毒的粒径为25～350 nm且大多接近或小于100 nm[11,16]，EVs的粒径介于30～1 000 nm且大多小于150 nm[17-18].根据瑞利散射定律，当球形颗粒的尺寸远小于激发光波长时，散射光强度随粒径的6次方衰减，公式如下[19]：

其中，σscatt是散射截面积，d是粒径，λ是激发光波长，nmed是颗粒周围介质的折射率，m是颗粒与介质的折射率的比值.通过计算σscatt可知，若要将散射光检测下限从PS微球的200 nm推进至100，40和25 nm，仪器的检测灵敏度需要分别提升64倍，15 625倍和262 144倍.因此对于生物纳米颗粒的散射检测，FCM面临严峻挑战.

采用荧光染料对生物纳米颗粒进行荧光标记，是促进FCM对生物纳米颗粒进行单颗粒检测的重要策略.传统流式细胞仪的荧光(以异硫氰酸荧光素(FITC)荧光通道为例)检测限约为500个FITC分子.随着粒径的减小，颗粒的表面积和内容物数量均大幅下降.以来源于细胞的EVs为例，假设细胞和EVs的直径分别为10 μm和100 nm，且生化分子密度相似，则EVs表面可被荧光标记的分子数量将比细胞少1万倍，内容物含量则比细胞少100万倍.由此可见，传统流式细胞仪的荧光检测能力也无法满足生物纳米颗粒的检测需求[20].因此，发展新型的FCM十分必要，将弥补现有FCM在检测能力方面的不足，极大地扩充其应用范围.

2 FCM灵敏度的提升历程

FCM自20世纪60年代发展至今，已经成为生物学、医学、环境监测等多领域不可或缺的技术.而FCM应用于生物纳米颗粒检测可以追溯到1979年，Shapiro课题组通过自行研制具有低流速、小探测体积(100 fL数量级)和较高激光功率(100 mW)等特点的流式细胞仪，实现了T2噬菌体(粒径约100 nm)与呼肠孤病毒(Reoviridae)空壳的散射光分辨，其中呼肠孤病毒空壳的散射光信号刚好能和背景区分[21].同年，Steen和Lindmo在荧光显微镜的基础上，发展了一种新型流式细胞仪[22]，将水以较小的角度喷射到显微镜盖玻片上后形成层流，在暗场条件下使用显微镜检测盖玻片上流体内的颗粒，该装置巧妙地解决了弧光灯照明区域大和散射光收集角度选择之间的冲突.这种设计在小角度(约2°)和大角度(约18°)均可以进行散射光检测，检测极限均约为200 nm的PS微球[23-24].2004年，Steen对激光作为激发源的流式细胞仪进行改良，通过增大散射光收集角度(16°～70°)并对鞘液进行一系列过膜处理(包括使用孔径0.1 μm的滤膜)以减少鞘液中的杂质颗粒，实现了74 nm的PS微球与尺寸约为100 nm的病毒的区分[11].

根据光散射理论，粒径大于入射光波长的颗粒主要在前向角方向对光进行散射.随着颗粒粒径减小，光散射角度变宽，更多的光沿垂直方向散射，而尺寸小于入射光波长的生物纳米颗粒正符合这种情况[10,19,25].因此，收集大角度的散射光甚至侧向散射光(side-scattered light,SSC)可以有效提升生物纳米颗粒的散射光检测灵敏度[26].为了拓展FCM在纳米颗粒分析中的应用，一些传统流式细胞仪厂商采取了一系列措施以提升灵敏度，包括收集大角度散射光、提高激光器功率、使用高性能PMTs和紫外光激光器等.例如：定制型BD Influx(配备200 mW的488 nm激光器及PMTs)将FSC收集角度范围从最初的2°～25°更改为15°～25°，以便阻挡对<15°杂散光的收集，从而提高信噪比并实现100和200 nm的PS微球的区分[27-29]；Beckman Coulter(BC) Gallios则提供了新的“W2 mask”选项，通过对收集到的8°～19°的FSC进行差分放大，使噪声降至最低[30-31]，可实现100和300 nm 的Megamix PS微球的基线分辨[31]；BC MoFlo Astrios EQ的散射光和荧光均可以轻松分辨100 nm PS荧光微球[32].值得一提的是，从Steen/Bio-Rad Bryte设计[33]演变而来的具有较高散射光检测灵敏度的Apogee系列A30/40/50/60-Micro流式仪器，可以测到100 nm PS微球，其专为检测微生物而设计，也同样适用于其他生物纳米颗粒的检测.该设备最多可对3个非固定角度范围的散射光进行收集，从而可以通过优化收集角度以识别尺寸小、信号弱的颗粒[34]，在检测亚微米尺度生物颗粒方面具有显著优势[15,35-37].以上科研实验室和流式生产厂商的努力均为拓展流式细胞仪在纳米颗粒分析中的应用奠定了基础.

3 nFCM的研发

图2 TEM、nFCM和NTA对SiNPs粒径分布表征的比较[17]Fig.2 Comparison of characterization of SiNPs size distribution measured by TEM,nFCM,and NTA,respectively[17]

为了拓展FCM在纳米颗粒检测中的应用，尤其是实现粒径小于100 nm的病毒、EVs、纳米药物等的检测，本课题组将瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术[38-40]相结合，通过四大策略成功研发了nFCM：1) 使用流体动力学聚焦技术压缩液流直径，减小探测区体积至皮升或飞升级；2) 延长单个纳米颗粒穿越激光探测区的时间至毫秒级，纳米颗粒被往复激发产生“光子爆发”，光电探测器可有效甄别出单个颗粒的光信号；3) 采用高量子产率的APD；4) 采用精准的光学成像系统结合视场光阑，有效滤除探测区外的杂散光干扰.自2006年起，经过8年3个阶段的不懈努力，于2014年将单个SiNP和纳米金的散射检测下限推进到24和7 nm，在国际上首次实现了发光能力低于单分子荧光的单个纳米颗粒散射信号的直接检测，散射检测灵敏度较传统流式细胞仪提升4～6个数量级，可对纳米颗粒悬液进行粒径快速表征；荧光检测灵敏度较传统流式细胞仪提高2～3个数量级，实现了单个藻红蛋白荧光信号的高信噪比检测[41].如图1所示，样品流在鞘液的作用下被压缩成很细的流束，确保所有的颗粒以同样的速率和路径逐一穿越整个激光探测区，不仅检测灵敏度高，而且信号均一.样品颗粒所发射的散射光和多色荧光信号经由高效能集光系统收集后由APD或PMT检测，实现多参数同时定量分析.nFCM以每分钟高达10 000个颗粒的速率对单个纳米颗粒的散射和多色荧光信号进行同时检测，仅需2～3 min即可实现纳米颗粒样本的粒径、浓度和多种生化性状的多参数定量分析.需要特别指出的是，nFCM对纳米颗粒粒径表征的分辨率可媲美透射电镜(transmission electron microscopy,TEM).如图2所示，nFCM与TEM均可实现5种不同大小SiNPs的基线分辨，且所得粒径表征结果几乎完全吻合；而纳米颗粒追踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)不仅因为展宽严重无法分辨这5种不同大小的SiNPs，而且其粒径测定结果和TEM结果相比明显偏大很多.nFCM可以像传统流式细胞仪分析细胞那样对细菌、病毒、亚细胞器、EVs、纳米药物、功能化纳米颗粒等在单颗粒水平进行高通量、多参数定量分析，填补了国际空白，在生命科学和生物医学研究以及纳米科技等领域具有巨大的应用前景，并已实现产业化(图3).

图3 厦门福流生物科技有限公司生产的纳米流式检测仪Fig.3 The flow nanoanalyzer of NanoFCM Inc.

4 nFCM对天然生物纳米颗粒的表征应用

4.1 单细胞水平细菌检测

通过单颗粒水平的高通量、多参数定量分析，FCM已广泛应用于微生物学研究，如检测食物、环境水样和临床样品中的病原菌和表征细菌对抗生素的应激响应等[42-49].然而传统流式细胞仪由于灵敏度的限制以及严重受制于鞘液中杂质颗粒的影响，不仅难以实现细菌与背景信号的完全分辨，可检测的生化参数也受到很大限制[47,50].利用nFCM装置，结合多种荧光标记策略，本课题组在单细胞水平实现了细菌的多种生物化学参数测定.

图4 nFCM在细菌检测中的应用Fig.4 Applications of nFCM in bacterial analysis

采用抗体、核酸共染法，通过nFCM对致病菌和总菌同时计数，本课题组在2010年发展了高灵敏、高特异性的细菌绝对定量分析方法，仅通过离心富集操作，即可实现初始浓度为1.0×102cfu/mL的大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7的准确定量分析[51].nFCM的超高灵敏性可以对单个细菌的绿色自发荧光进行定量检测.利用FITC亮度已知的荧光纳米标准球对细菌的自发荧光进行标定，发现单个细菌自发荧光的亮度在80～1 400个FITC分子范围，这是国际上首次对单个细菌的自发荧光进行FITC当量报道[52].借助β-半乳糖苷酶(β-gal)这一最常用的基因表达报告分子，本课题组采用β-gal的亲脂性荧光底物C12FDG对细菌进行染色，通过nFCM对单个细菌荧光信号的检测，结合荧光定量法及nFCM快速细胞计数，实现了单个细菌中本底表达β-gal拷贝数的定量表征[53]，该方法可应用于单细胞水平低丰度蛋白的定量分析，有效揭示细菌分子含量和表型的异质性.本课题组制备了38种粒径(180～880 nm)高度均一的SiO2亚微米颗粒标准品，采用nFCM对单个颗粒的散射光强度进行高灵敏检测，在实验水平高精度地描绘了亚微米颗粒散射光强度与粒径的关系曲线(图4(a))；结合米氏散射理论，发展了一种对亚微米颗粒粒径进行快速测定的方法,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的粒径测定结果表明该方法的准确性和分辨率可媲美TEM[54].通过同源重组技术对肠出血性大肠杆菌O157:H7的噬菌体PP01进行基因改造，重组噬菌体保留其对宿主菌的特异侵染能力，并在宿主菌内部快速繁殖，每一个子代噬菌体的外壳蛋白都带有重组的四半胱氨酸标签，经跨膜的双砷染料特异标记，产生强烈的荧光，可被nFCM高灵敏地检测[55].进而结合双砷染料-四半胱氨酸(FlAsH-TC)标记体系，发展了灵敏的毒素与抗毒素(toxin-antitoxin，TA)的单细菌水平研究方法(图4(b))，发现：天然启动子指导下的TA系统在无环境压力时存在高表达与低表达MqsA抗毒素蛋白的两个细菌亚群；在环境压力如胆汁应激、热激和氨基酸饥饿条件下，这两个细菌亚群通过不同的反应来调控MqsA的降解或表达.这种分析方法将为TA系统的异质性及作用机理分析提供先进的技术手段[56].

随着抗生素的大量使用和滥用，细菌耐药已严重威胁人类健康.在多种细菌耐药机制中，细菌产生β-内酰胺酶是80%病原菌耐药的主要原因.本课题组与新加坡南洋理工大学邢本刚教授课题组合作，发展了针对TEM-1型β-内酰胺酶且具有共价结合能力的荧光共振能量转移(FRET)探针LBRL1，利用nFCM实现了单细胞水平细菌对β-内酰胺类药物耐药性的检测，可测定混合菌中比率低至5%的耐药菌[57].本课题组进一步使用TEM-1型β-内酰胺酶的单克隆抗体对位于细菌周质空间的β-内酰胺酶进行免疫荧光标记，同时采用核酸染料对细菌DNA进行染色，采用nFCM对单个细菌的散射和双色荧光进行同时检测，可检测到混合菌中比率低至0.1%的耐药菌，远低于传统的药敏纸片法和显色底物头孢硝噻吩法10%的检测限(图4(c)).该方法成功实现了抗生素环境下敏感菌致死、耐药菌逐渐生长为优势菌的动力学监测以及临床尿样中细菌的无培养直接快速检测[58].

食品安全是人类健康的首要因素，将nFCM应用于各类食品中细菌的快速检测是本课题组的重点研究方向之一.利用SYTO 9和碘化丙啶(propidium iodide，PI)核酸染料分别对总菌和死菌进行荧光标记，本课题组发展了酸奶和益生菌饮料中益生菌浓度和存活率的快速检测方法[59].仅仅采用PicoGreen标记细菌核酸，nFCM可以在20 min内准确地定量饮用水和茶饮料中的总细菌浓度[60].通过建立鸡蛋样品前处理方法，结合核酸和免疫荧光染色，nFCM可直接对鸡蛋中的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和细菌总数进行定量检测，该方法可在1.5 h内完成，细菌回收率为93%，检出限低至2×103mL-1，对鼠伤寒沙门氏菌的特异性接近100%[61].尽管通过核酸染色使得细菌可以通过荧光信号与样本中的非生物类杂质颗粒加以区分，而且可以检测所有的细菌，但是当样本中含有植物细胞、动物细胞的碎片或游离核酸时，碎片对染料的吸附作用以及游离核酸的荧光信号均会对检测结果产生严重干扰.利用nFCM能对细菌自发荧光进行检测的性能，通过优化样本前处理方法，本课题组发展了果汁中细菌的无标记快速检测方法(图4(d))，对苹果汁中细菌的检测下限为100 mL-1[62].

4.2 单细胞器水平线粒体的多参数检测

线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且在多种诱因引发的细胞凋亡信号转导中起着至关重要的中枢调控作用[63-64].由于细胞内线粒体的形态和功能存在高度的异质性，相比于全细胞分析或蛋白免疫印迹(Western blot)技术，高通量的单线粒体检测不仅能揭示因集权平均而被掩盖的个体差异，而且可以简化样品的复杂性，使实验数据的解析更加简洁、明确.然而，线粒体个体微小且折射率低，传统流式细胞仪难以对单个线粒体进行高灵敏的多参数检测.利用nFCM检测装置，本课题组建立了单线粒体水平的多参数、高通量分析方法.

采用线粒体内膜心磷脂特异性荧光探针(NAO)和核酸探针(SYTO 62) 对线粒体进行标记，利用nFCM在单颗粒水平对双荧光标记的线粒体进行检测(图5(a)).通过散射光通道与两个荧光通道信号的时间相关性，可定量分析所提取线粒体的纯度和结构完整性，并从单细胞器水平揭示线粒体的异质性[65].采用抗癌药物直接刺激提纯的人宫颈癌HeLa细胞线粒体，经线粒体膜电位荧光探针染色后，利用nFCM分析药物作用前后单个线粒体形态(散射光)和膜电位(荧光)的变化，发展了靶向线粒体抗肿瘤药物的nFCM快速筛选方法(图5(b)).通过对8种临床抗癌药物的测试发现，桦木酸、抗霉素A、紫杉醇、姜黄素、雷公藤甲素、ABT-737具有浓度依赖的线粒体膜电位下降趋势，而放线菌素D和顺铂则不能直接作用于线粒体[66].结合基于质粒转染的线粒体荧光标记手段，利用nFCM建立线粒体融合的高通量定量检测方法，并将其应用于线粒体融合与凋亡的关系研究(图5(c)).结果表明凋亡的信号转导通路负向地调节线粒体融合行为，融合也会协助癌细胞抵抗死亡；该方法被进一步用于融合抑制剂的识别与筛选[67].此外，为了实现单线粒体水平细胞凋亡相关Bcl-2和Bax蛋白的测定，本课题组采用荧光标记的特异性抗体mAb-AF488和核酸染料对HeLa细胞提纯线粒体进行荧光标记，使用nFCM对单个线粒体的散射和双色荧光信号进行同时检测，建立了快速、准确的单线粒体水平蛋白数量及其分布的测定方法(图5(d)).研究发现单个线粒体表面的蛋白分布存在着巨大的差异性，当细胞受到凋亡药物刺激9 h后，Bax从胞浆转位到线粒体，线粒体表面的拷贝数增加4.4倍；该方法为深入研究线粒体介导的细胞凋亡信号转导提供了先进的分析手段[68].

4.3 单颗粒水平病毒无标记检测

病毒是自然界中分布最广、基因多样性最强的生命形式，是许多致死性疾病的罪魁祸首，给人类的生命健康和社会安定带来严重威胁[69].近年来，病毒也被用作医学诊断和治疗的试剂、基因传递的载体、抗菌剂以及纳米材料基元等[70-71].发展高分辨、高通量的病毒粒径及其分布表征技术对于病毒学研究、疾病诊断和治疗等具有重要意义.然而现有的病毒表征方法如TEM和动态光散射存在检测速度慢或者分辨率不足等缺点.随着仪器、荧光染料和标记策略的进步，流式细胞仪被应用于病毒或病毒样颗粒的单颗粒水平测定，称为流式病毒术(flow virometry)[16，72-73].但病毒粒径微小(25～350 nm)，所含生物化学成分极其微量，给流式病毒术的检测带来严峻挑战.本课题组通过提高nFCM的激光功率密度和进一步降低探测区体积等策略，发展了一种无标记的病毒颗粒快速、准确的测定方法[13].该方法实现了对粒径只有27 nm的轻小病毒(MS2) 的单颗粒散射检测(图6).通过单个病毒颗粒散射光强度的测定实现病毒颗粒粒径及其分布的准确测定，对等效球体粒径仅相差4 nm 的T7和Lambda噬菌体实现基线分辨，能分辨PP01噬菌体尾部伸长或收缩的两种形态.此外，单颗粒检测使nFCM对杂质颗粒的影响不敏感，更适合于分析多分散或者混合物样品，并成功地应用于病毒样本的纯度测定和病毒基因组释放过程的动态监测.相对于传统的TEM表征技术，该方法对病毒悬液进行直接检测，将分析时间从数小时缩短至几分钟，统计精确性高、实用性强，为病毒研究提供了一种新型的高效分析手段.

4.4 单颗粒水平EVs检测

EVs是一种由细胞释放到细胞外基质中的纳米尺度的膜性小囊泡，主要包括从细胞膜直接出芽脱落的微囊泡(microvesicles,MVs)和多泡体与细胞膜融合释放的外泌体两大类，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤生长等过程，广泛地存在于各种体液和细胞上清中，在疾病诊断、预后和治疗中显示出巨大的应用前景[74-78].由于EVs的粒径及其携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”随细胞来源、细胞状态以及分泌途径的不同而存在高度的异质性和多样性，所以亟需发展一种单颗粒水平的高通量、多参数定量分析技术，以揭示EVs的个体差异，鉴定发挥重要作用的EVs亚群.然而，绝大多数EVs的粒径小于100 nm，特异性蛋白的表达量极低且异质性大，对其在单颗粒水平进行多参数定量检测一直存在诸多挑战.基于米氏散射模型的散射光与粒径的关系，2018年van der Pol等[79]对各种商品化流式细胞仪可检测到的EVs的粒径范围进行了评估，发现只有少数几款高灵敏设备(包括Apogee A50- Micro、BD influx和BD LSR Ⅱ)可以检测300～600 nm范围的EVs，其他常规配置的流式细胞仪只适用于检测粒径范围在600～1 200 nm和/或1 200～3 000 nm的大尺寸EVs.

针对这一难题，本课题组使用具有极高侧向散射检测灵敏度的nFCM检测技术，实现了对粒径低至40 nm 的EVs的单颗粒水平多参数定量检测[17].如图7所示，仅需几分钟即可获得具有高度统计代表性的EVs粒径分布特征，分辨率和准确性媲美冷冻TEM(Cryo-TEM).在临床样本检测方面，仅需50 μL血浆样本即可实现血浆中EVs的颗粒浓度测定；结合免疫荧光标记，通过对血浆中CD147阳性EVs的颗粒浓度测定，实现了结直肠癌的早期诊断(p<0.001) 和预后分析(p<0.05).nFCM使得研究人员能够像用传统流式细胞仪分析细胞那样对EVs进行多参数定量检测，可为EVs的异质性分析、母细胞的来源鉴定以及基于EVs的诊断标志物的探寻和治疗制剂的开发等提供先进的分析表征手段.

图7 单颗粒水平表征EVs的粒径和表面蛋白[17]Fig.7 Characterization of particle size and surface protein of EVs at the single-particle level[17]

围绕如何定量评估EVs纯化效果这一亟需解决的科学难题，本课题组基于nFCM高灵敏、高通量以及多参数的单颗粒表征优势，对目前常用的6种纯化方法(超速离心和5种基于聚合物沉淀、尺寸排阻或膜亲和吸附等原理的试剂盒)对血浆中EVs的纯化效果进行了评估[80]：与超速离心法相比，试剂盒将血浆中大量的非囊泡组分一并纯化，虽然分离后的样本颗粒浓度较超速离心样本高出2～4个数量级，但是纯度却低得多.结合免疫荧光染色，nFCM在单颗粒水平实现了对血浆中来源于红细胞、白细胞、血小板和血管内皮细胞的EVs亚群比例和浓度的定量分析.

nFCM在EVs的粒径分布、浓度等物理参数以及核酸、特定蛋白等生物化学性质的表征中均展现出显著的优势，由该技术转化的商品化纳米流式检测仪Flow NanoAnalyzer销售到全球顶尖科研机构、医疗单位和高科技企业，应用于EVs的基础研究和药物开发.例如，美国梅奥医学中心(Mayo Clinic)的王海龙教授课题组采用nFCM对不同电刺激条件下大鼠星形胶质细胞分泌的AQP4阳性EVs的浓度和粒径进行表征，发现胞外电刺激可调节神经细胞EVs的释放及内含物组成，推进了EVs在帕金森综合征等神经退行性疾病领域的应用[81].2020年9月15日，美国Codiak BioSciences公司宣布其开发的世界首个工程化外泌体治疗候选药物exoIL-12进入Ⅰ期临床试验，其在递交的专利中明确指出利用nFCM发现该基因改造外泌体几乎100%表达目的蛋白PTGFRN，这对治疗效果的提高提供了极大的保障[82].

5 nFCM对人工合成纳米粒子的表征应用

随着纳米生物技术的飞速发展，具有独特结构与功能的人工合成纳米颗粒在药物的靶向传输、肿瘤的高分辨成像(核磁和荧光)、疾病诊断、蛋白纯化、病原体检测等生物医学以及食品安全、环境监测等领域正发挥着越来越重要的作用.然而，纳米颗粒尺度微小且单个粒子携载功能化试剂的容量有限，使得单个纳米颗粒的多参数定量检测极具挑战性.

5.1 单颗粒水平纳米药物多参数定量表征

针对纳米颗粒表征这一国际公认的严重阻碍纳米药物从实验室研究到临床应用的瓶颈问题[1]，本课题组利用nFCM，以阿霉素脂质体和携载小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)的脂质纳米粒(lipid nanoparticles,LNPs)为模型，建立了纳米药物载药率、粒径、载药量、颗粒浓度等的单颗粒水平多参数定量表征技术，不仅能揭示因集权平均而被掩盖的个体差异，而且能实现各种物理化学和生物化学参数之间的高度相关分析，可为纳米药物的研发和质量控制提供重要的技术保障.

FL.荧光；PET.正电子发射型计算机断层显像；MRI.磁共振成像.图8 nFCM应用于纳米药物的多参数表征[41]Fig.8 Multi-parameter characterization of nanomedicine by nFCM[41]

阿霉素脂质体是美国食品药物管理局(FDA)批准的首个临床抗肿瘤纳米药物，其粒径分布和单个颗粒包裹的阿霉素含量的表征需要使用Cryo-TEM结合复杂的三维断层扫描重构技术，花费2～3 d 的功夫.如图8所示，本课题组使用nFCM检测技术对阿霉素脂质体悬液进行单颗粒水平的多参数测定，借助不同粒径的标准球，仅需2～3 min即可实现阿霉素脂质体粒径和阿霉素自发荧光亮度的定量表征，而且可在单颗粒水平对颗粒粒径和包裹的阿霉素含量进行相关分析[41].为了实现阿霉素脂质体内部阿霉素分子数量的定量表征，本课题组合成了一系列不同粒径的阿霉素脂质体，采用Cryo-TEM对其进行粒径表征，使用荧光分光光度计和纳米流式检测仪对其平均阿霉素分子含量进行表征，通过建立nFCM散射光强度与粒径的标准工作曲线，以及nFCM荧光强度与阿霉素含量的标准工作曲线，发展了脂质纳米药物的单颗粒水平多参数定量表征方法，实现了对商品化阿霉素脂质体Doxoves和gDoxil的粒径和载药量的快速表征[83].携载siRNA的LNPs是目前临床证实最具潜力的RNA干扰药物，但是对于其颗粒浓度和siRNA的装载比率这两项指标，国际上尚缺乏有效的表征手段.由于LNPs的电子密度在装载siRNA前后并未发生明显变化，即便采用Cryo-TEM也无法确认LNPs是否装载了siRNA.本课题组采用跨膜核酸染料SYTO 82对siRNA-LNPs进行荧光标记，在nFCM上同时检测单个纳米药物颗粒的散射和荧光信号，结果表明空白LNPs和siRNA- LNPs在二维散点图上可以完全区分[41].本课题组利用nFCM检测装置帮助全球基因治疗纳米药物的领航者——美国Alnylam Pharmaceuticals对其临床Ⅱ期siRNA-LNPs的浓度和siRNA装载比率进行测定，为其提供了完美的技术解决方案.nFCM超高的灵敏度、卓越的分辨率和多参数同时分析的能力为脂质体纳米药物的表征提供了一种快速、高通量的新方法.

5.2 单颗粒水平量子点的定量表征

量子点是一种具有量子限域效应的零维荧光纳米材料，具有发射波长窄且对称、斯托克斯位移较大、光稳定性好以及通过调控尺寸可以调控发射波长等优异的光学性质.在量子点的生产合成及生物应用中，研究人员需要准确地了解量子点的浓度、发光性能及其均一性、生物试剂偶联之后是否导致量子点聚集等物理、化学性状.现有的量子点检测方法仅能对量子点的浓度进行估计，存在误差大且难以获知量子点发光性能异质性等不足.本课题组通过对nFCM光学系统、液流系统的改进，仪器的荧光检测灵敏度较原有仪器提升2.8倍，单个藻红蛋白荧光信号的信噪比高达34，单个Qdot655量子点检测的信噪比高达88，由此建立了量子点的单颗粒水平荧光定量表征方法[84].该方法可对量子点的发光强度及其均一性、颗粒团聚程度、颗粒浓度，以及环境因素对其发光性能的影响等进行快速表征，对于指导量子点的合成优化、质量控制和生化分析应用等具有重要意义.

6 nFCM的前景展望

nFCM的成功研发和最新进展使得人们能够以更高的灵敏度和准确性对纳米尺度生物颗粒的数量、大小、组成、表型等物理和生化性状进行多参数同时定量分析，将为相关疾病的发生、发展以及诊断、治疗和预防提供全新视角.未来，nFCM的发展主要包括3个方面：1) 开发多样性应用，不同领域的研究人员可以利用nFCM来攻克一些当前难以解决的纳米尺度生物学及材料学问题.除了上述讨论的细菌、线粒体、病毒、EVs、纳米药物外，nFCM在染色体、核糖体、溶酶体等生物纳米颗粒的分析领域也具有巨大的应用前景.2) 进一步深入开展nFCM在细菌、病毒、EVs表征方面的应用，建立更多快速、便捷的食品安全、环境监测、生物医药相关方法和技术，如血液等复杂样品中低丰度细菌、病毒的快速定量检测，以及纳米药物、病毒疫苗生产过程的质量控制等.此外，nFCM在EVs分析中的应用才刚刚起步，借助nFCM可以揭示EVs在细胞通讯、疾病尤其是肿瘤发生发展中的作用.3) 进一步提升nFCM仪器性能.如研制纳米流式光谱检测系统，突破滤光片分光面临的光谱重叠所造成的检测参数限制.光栅光谱仪和电子倍增电荷耦合元件(EMCCD)相结合不仅能对流动状态下单细胞的荧光光谱进行快速捕获，而且能获得单个细菌、细胞器、功能纳米颗粒的荧光光谱，实现无需荧光补偿的多参数分析，满足生命科学前沿研究、生物医学和纳米科技的发展需求.多参数检测意味着数据维度的提升，需要开发高维度流式数据处理算法及软件以自动化处理、分析数据，充分挖掘数据中的信息，发挥纳米流式光谱检测技术的优势.以上3个发展方向相辅相成，将不断拓展仪器应用领域，为纳米颗粒的超高灵敏检测提供强有力的分析手段.