三羟基咔咯及其镓配合物(-Ga)在新型抗肿瘤药物研发中的应用及对人肺癌细胞(A549)增殖的影响①

张 静，赵 天，丁亚楠，赵晓飞

（1邢台市第三医院药剂科，河北邢台054000；2邢台医学高等专科学校第二附属医院临床药学科，河北邢台054000）

癌症是现代医学上尚未攻克的重大难题，发现和开发安全有效的新型抗肿瘤药物是医药学界的不懈追求。卟啉类化合物不仅在生物和材料化学领域发挥重要作用，且有研究证实卟啉是一种具有巨大开发潜力的抗肿瘤药物[1]。咔咯（Corrole）是人工合成的一种类卟啉大环化合物，其结构上含有18-π电子的共轭结构，能够与金属离子发生结合生成具有高稳定性的金属配合物，而咔咯及其金属配合物的抗肿瘤效果已得到初步证实[2]。近来研究表明咔咯及其金属配合物抗肿瘤作用发挥主要与卡洛及金属配合物表现出的独特光物理特性有关，其可以发挥光核酸酶活性并与DNA链之间产生非共价结合，从而导致DNA链发生断裂[3]。目前咔咯及其配合物的研究主要集中于铁、钴等配合物，关于中心金属为镓的咔咯配合物研究较少；而近来研究发现已镓或磷作为中心金属的咔咯配合物可以在光照条件下发挥出质粒DNA断裂功效，并具备化学核酸酶活性。因此探讨高效低毒的咔咯配合物对进一步开拓大环类新型抗肿瘤化合物具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人肺癌细胞(A549)株购自上海匹拓生物科技有限公司，品牌为美国Scien Cel。

1.1.2 仪器和试剂 旋转蒸发仪（厂家：常州市国旺仪器制造有限公司，型号：RE501）；高速冷冻离心机（德国SIGMA，型号1-14K）；低速离心机（厂家：上海安亭，型号：TDL-50）；流式细胞仪（厂家：Beckman Coulter，型号：Gallios）；荧光显微镜（厂家：德国莱卡公司，型号：DMi8）；CO2细胞培养箱（厂家：上海力申科学仪器有限公司，型号：HFI60W）；紫外分光光度计（型号：安捷伦；型号：Cary 3500）；实时荧光定量PCR仪（厂家：美国Bio-Rad，型号：CFX86）；酶标仪（厂家：美国Bio-Rad，型号：CFX86）。线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自Abcam公司；胰酶、胎牛血清、青链霉素、DMEM培养基购自美国Gibco公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma；PBS购自武汉博士德。

1.2 方法

1.2.1 配合物的合成 将73 mg 10-（4-羟基苯基）-5,15-二（五氟苯基）咔咯以及2,2'-二羟基二乙胺400 μL分别加入25 mL圆底烧瓶中，采用4 mL无水二甲基亚砜将反应物充分溶解；然后放置于磁力搅拌器以500 r/min进行回流，2 h后停止反应。经柱层析法去除杂质和纯化后重结晶，得到目标产物三羟基咔咯（咔咯1）。取60 mg咔咯1置于25 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水吡啶充分将其溶解，迅速加入过量氯化镓（约100 mg）进行化学反应；加氮气保护，置于磁力搅拌器以500 r/min回流1.5 h后停止。经柱层析法分离去除杂质后重结晶，得到目标产物镓配合物（1-Ga）。

1.2.2 噻唑蓝比色法（MTT）将A549细胞培养板继续置于CO2培养箱进行细胞贴壁生长24 h，将A549细胞分为3组，分别为对照组、咔咯1组和1-Ga组。具体为对照组将原有培养基更换原有的新鲜培养基，咔咯1组和1-Ga组将原有培养基更换为咔咯1和1-Ga培养基（浓度为1.5～100μmol/L）。待继续孵育4 h后，3组分别在光照和黑暗下进行培养，其中光照置于625 nm红光下光照1 h，黑暗则置于避光的黑暗条件下，随后均继续培养48 h。然后将所有培养板去除后弃取原有培养基，加入10μL MTT溶液/孔，再加入90μL新鲜培养基/孔继续孵育4 h。再取出将含有MTT培养基去除，更换成100μL DMSO，然后放置于摇床中，待结晶产物溶解后使用酶标仪测定470 nm波长处光密度值（OD470）。并使用Graphpad Prism7.0对数据进行处理，得到目标化合物的半数最大抑制浓度值（IC50）值。OD值越大表示细胞活性越强即化合物毒性越小。其中细胞存活率=（含药实验组OD/对照组OD）×100%[4]。

1.2.3 细胞形态观察 待A549细胞完成过夜贴壁生长后，将原有培养基弃去，对照组更换新鲜培养基，咔咯1组和1-Ga组分别更换为浓度为3μmol/L的咔咯1和1-Ga培养基，继续培养4 h后将其取出置于625 nm红光下光照1 h，然后继续孵育12 h。使用PBS溶液冲洗2遍后于显微镜下观察细胞形态。

1.2.4 线粒体膜电势的变化 待A549细胞完成过夜贴壁生长后，将原有的培养基弃取，对照组更换新鲜培养基，咔咯1组和1-Ga组分别更换为浓度为3 μmol/L的咔咯1和1-Ga培养基，另外单独设置一组在对照组基础上加入适量具有诱导细胞凋亡作用的羰基氰3-氯苯腙（CCCP）作为阳性对照组。继续培养4 h后将其取出置于625 nm红光下光照1 h，然后继续孵育12 h。使用PBS溶液冲洗2遍后，于每孔中加入稀释后的线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)染色工作液约1 mL。然后对其进行避光20 min处理，再次使用JC-1染色缓冲液冲洗两次后补充2 mL培养液，于荧光显微镜下观察细胞线粒体膜电势的变化。

1.2.5 咔咯1、1-Ga抑制异种移植斑马鱼模型中A549细胞生长和转移影响 将正常受精后的转基因荧光斑马鱼放置于培养皿中，然后加入链蛋白酶溶液，随后将斑马鱼随机分配于6孔板中，将Dil标记的A549细胞（红色）显微注射入斑马鱼胚胎中以构建肿瘤斑马鱼模型，并使用3μmol/L的咔咯1和1-Ga连续处理72 h，该阶段置于28.5℃恒温光照培养箱中培养孵育，然后将斑马鱼洗净转移至96孔板中，放置于荧光显微镜下观察斑马鱼A549细胞生长和转移影响，并进行拍照。

1.2.6 流式细胞仪检测A549细胞凋亡及细胞周期将CO2培养箱中的处于对数期生长的A549细胞取出，待细胞完成过夜贴壁生长后，将原有的培养基弃取，对照组更换新鲜培养基，另外两组分别更换为浓度为3μmol/L的咔咯1和1-Ga培养基，弃去孔板里的培养基，继续培养4 h后将其取出置于625 nm红光下光照1 h，然后继续孵育12 h。使用PBS溶液冲洗两遍后，于每孔中加入经稀释后胰酶溶液（浓度0.25%）对细胞进行消化30 s。然后离心5 min（离心速度1000 r/min）后将细胞沉淀收集。使用PBS溶液冲洗两遍后加入碘化丙啶染色液染色，待完成充分重悬后将其置于37℃条件下进行避光孵育30 min，使用流式细胞仪对细胞凋亡情况检测，并采用Modfit软件进行细胞周期分析。

2 结果

2.1 体外细胞毒性 咔咯1组和1-Ga组均对A549、MCF-7、HepG2 3种肿瘤细胞存在光毒性和暗毒性，且在光照条件下的半抑制率（Half inhibition rate，IC50）远小于黑暗条件下半抑制率（P＜0.05）。光照条件下1-Ga对MCF-7、A549肿瘤细胞以及黑暗条件下1-Ga对MCF-7、HepG2、A549肿瘤细胞的IC50小于咔咯1（P＜0.05）。见表1。

表1咔咯1和1-Ga对A549、MCF-7、Hep G2细胞的体外细胞毒性（-x±s，μmol/L）

2.2 细胞形态学观察光照条件下咔咯1和1-Ga均能抑制A549细胞增殖。相较于对照组，咔咯1组和1-Ga组均对A549细胞的外观形态产生明显影响：多边形梭型贴壁细胞由密集状态转变成圆形卷曲状态，且细胞密度明显降低且出现细胞碎片和细胞死亡；且1-Ga处理的细胞形态学变化更显著，见图1。

图1光照条件下咔咯1和1-Ga对A549细胞的形态学影响

2.3 线粒体膜电势检测对照组A549肿瘤细胞呈现强烈红色荧光，线粒体膜电势处于正常水平；光照条件下使用咔咯1和1-Ga处理后的A549肿瘤细胞线粒体膜电势下降，诱导细胞发生凋亡且呈现绿色荧光，见图2。

2.4 咔咯1、1-Ga抑制异种移植斑马鱼模型中A549细胞生长和转移影响对照组在未进行任何药物干预下，72 h时经Dil标记的红色A549细胞在斑马鱼中显著增殖并向尾部转移；分别加入咔咯1、1-Ga干预处理72 h，红色荧光的A549细胞转移程度明显降低，且1-Ga组A549细胞转移程度相比咔咯1组更低。见图3。

图2咔咯和1-Ga对A549细胞线粒体膜电位影响

图3咔咯1、1-Ga抑制异种移植斑马鱼模型中A549细胞生长和转移影响

2.5 咔咯1、1-Ga对细胞周期和凋亡情况的影响对 照组A549细胞大部分位于G0/G1期，经咔咯1、1-Ga作用后，咔咯1组A549细胞S期比例变化不大，1-Ga组A549细胞S期比例明显降低（P＜0.05）；且对照组中99%以上的A549细胞存活，咔咯1、1-Ga处理过后的A549细胞存活比例均下降，分别为90.9%、49.9%，且观察到经咔咯1、1-Ga处理过后的早期凋亡细胞比例分别为4.2%和45.0%，晚期凋亡细胞比例分别为3.2%和47%；且1-Ga组细胞凋亡比例显著高于咔咯1组（P＜0.05）。见图4～5。

图4流式细胞术分析咔咯1、1-Ga对A549细胞细胞周期分布影响

图5流式细胞双染分析咔咯1和1-Ga对A549细胞凋亡影响

3 讨论

卟啉类化合物是一种光动力抗肿瘤药物，咔咯化合物因与卟啉化合物具有相似的大环共轭结构，其在抗肿瘤领域中的作用逐渐凸显[5]。以往合成咔咯配合物主要采取金属离子模板法，但得到的金属配合物种类有限，如钴咔咯配合物。通过合成方法的逐渐改良和优化，目前主要合成方法是先合成自由咔咯，再加入过量离子盐于有机溶剂中反应获得对应配合物[6]。本文通过采用第二种合成方法，将5,15-二（五氟苯基）-10-（4-羟基苯基）咔咯化合物与2,2'-二羟基二乙胺亲核试剂发生取代反应以合成得到meso位上含有2个乙羟基和一个苯羟基的新咔咯1化合物，然后通过加入过量氯化镓形成金属配合物1-Ga。

咔咯1在光照条件下可以有效将DNA链切断，且单线态氧是咔咯1的主要活性氧物种，而1-Ga光照条件下断裂DNA涉及的是单线态氧和羟基自由基，因此有望将其作为光敏剂应用于光动力疗法以治疗恶性肿瘤[7]。本研究结果进一步证实1-Ga相比咔咯1对肿瘤细胞的细胞毒性更强。已有研究证实在光照条件下，当1-Ga浓度增加至120μmol/L时，1-Ga可以导致80%以上的肿瘤细胞DNA断裂，而咔咯1浓度增至160μmol/L时只能导致50%DNA发生断裂[8]。证实咔咯1-Ga相比咔咯1具有更好的光核酸酶活性，与本文研究结果一致。研究报道咔咯与DNA的相互结合有插入模式、外部结合模式以及自堆积结合模式，而研究咔咯配合物与DNA结合方式与咔咯类似，也可分为嵌插结合、外部结合以及伪插入结合三种类型[9-10]。而配合物与DNA的所有非共价结合都是基于两者之间的一种弱相互作用力如氢键范德华力、离子键等[11]。因此推测本研究中咔咯1及1-Ga对A549的细胞作用也可能是通过上述方式与DNA结合并导致DNA链发生断裂产生，但具体机制仍有待进一步研究揭示。

线粒体作为细胞发生凋亡过程的关键细胞器，细胞受损位点及死亡受体传递的信号均会汇集于线粒体上，最终引发线粒体膜的通透性发生改变以及膜电位的降低甚至消失。而线粒体内膜电位是电子能量由质子泵传递至细胞质侧的一种反映，当线粒体膜电位发生显著降低常代表细胞发生凋亡[12]。而JC-1、罗丹明123等亲脂性阳离子荧光染料均具有一定的线粒体聚集倾向，因此可以通过观察荧光染料的荧光颜色或者强度变化判断细胞内线粒体膜电势变化趋势[13]。本研究发现正常细胞线粒体呈红色荧光，主要是由于正常细胞线粒体内膜电位较高，JC-1染料在线粒体基质内形成聚合物且发出红色荧光；而非正常线粒体中膜电位发生降低或丧失后，染料呈现出一种单体状态并发生绿色荧光，因此可以通过荧光颜色变化判断线粒体膜电位变化情况，进而判断细胞的凋亡进程。本研究结果进一步证实咔咯1和1-Ga对A549的细胞毒性，会破坏细胞的线粒体功能。发现未经任何处理的对照组A549细胞大部分位于G0/G1期，经咔咯1、1-Ga作用后，咔咯1组A549细胞S期比例变化不大，1-Ga组A549细胞S期比例明显降低（P＜0.05）；且1-Ga组细胞凋亡比例显著高于咔咯1组（P＜0.05），说明咔咯1和1-Ga可以诱导S期细胞周期发生阻滞。已有研究证实咔咯1和1-Ga在光照条件下均可产生单线态氧，且1-Ga的光核酸酶活性更强的根本原因可能是其具有更快的单线态氧产生速率[13]。因此推测其细胞周期阻滞机制可能是咔咯化合物通过活性氧(ROS)介导线粒体途径诱导A549发生凋亡。本研究通过构建斑马鱼模型证实经咔咯1、1-Ga干预处理后A549细胞发生细胞生长和转移的程度明显降低，且1-Ga组A549细胞转移程度相比咔咯1组更低，进一步证实两者对A549细胞的转移具有抑制作用及其抗肿瘤功效。

综上所述，咔咯1及1-Ga均具有强烈核酸酶活性，均可抑制A549增殖、转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，且1-Ga细胞毒性更强，有望成为一种新型抗肿瘤药物应用于恶性肿瘤的治疗。