雷帕霉素对Yap1-β-连环蛋白诱导儿童肝母细胞瘤抑制作用的研究①

任 慧，赵天娇，张 娟，陈秀珍，刘 锋，牛会忠

（河北省儿童医院普外科，河北石家庄050000）

肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）发病率约为2.46/100万，是最常见的儿童肝部恶性肿瘤，多见于2岁以下婴幼儿。HB的发病率呈逐渐升高趋势[1]。HB的发病机制尚未完全阐明，Beckwith-Wiedemann综合征、家族性腺瘤性息肉、低出生体质量早产儿等均增加HB的发病风险[2]。手术切除联合术后辅助化疗是HB的主要治疗模式，是患者长期无瘤生存的有效方式。随着治疗水平的提高，HB的预后明显改善，低危HB患儿的5年生存率约为80%～90%，但仍有部分因为化疗耐药、术后残留等因素出现术后复发，影响治疗效果。对HB分子机制的研究有助于更好的了解HB的发病机制，探讨新的治疗方法[3]。虽然HB发病率较低并呈散发性，仍有几项小样本的队列研究显示β-连环蛋白（β-catenin）途径是导致HB的重要始动因素[4]。已有研究显示，在60%～70%的HB病理组编码β-catenin的CTNNB1基因存在缺失或错义突变，破坏β-catenin的磷酸化和降解，导致活性β-catenin持续累积于细胞核和细胞浆中，持续活化下液靶基因，参与肝母细胞的发生[5]。Patel等[6]研究显示，多数HB病例中转录共刺激因子-Yes相关蛋白（yes-associated protein,YAP）被激活，约80%的HB患者可检测到YAP和β-Catenin的协同活化。在小鼠中运用高压尾静脉注射技术共转染功能活化形式的YAP1和β-catenin可促使HB形成，但其具体机制仍不清楚。本研究注射YAP1-β-catenin诱导HB，采用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）抑制剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）进行干预，探讨抑制mTOR对Yap1-β-连环蛋白诱导的儿童肝母细胞瘤生长发育的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级FVB/N小鼠18只，8～10周龄，体重20～25g，购于山东大学实验动物中心。动物许可证号[SCXK（鲁）2018-103]，山东大学医学院实验动物中心使用许可证号[SYXK（鲁）2018-131]。实验动物采用12h光照-黑暗循环，自由饮水和进食。pt3-ef1αyaps127a和pT3-EF1α-ΔN90-β-catenin由大连宝公司构建。

1.2 方法

1.2.1 造模和干预 常温融解pt3-ef1α-yaps127a和pT3-EF1α-ΔN90-β-catenin，将10μgpt3-ef1α-yaps127a、10μgpT3-EF1α-ΔN90-β-catenin和4μg PCMV/SB混合于2 mL生理盐水中。每只小鼠通过高压尾静脉注射转染法注射2 mL，小鼠取双侧尾静脉进行注射，注射过程5～9 s，推注成功可见小鼠短暂性呼吸急促、活动力减弱等心衰症表现[7]。注射完毕后随机将小鼠分为对照组和观察组各9只，对照组小鼠在注射后保持10周正常饮食，观察组在注射后保持5周正常饮食，然后采用含19 mg/kg RAPA的饮食治疗5周。

1.2.2 超声检查 于注射后第4周、7周、8周、9周、10周对小鼠行超声检查。采用Vevo®3100小动物超声成像平台进行评估小鼠的肝脏体积和肝脏肿瘤，探头频率20 MHz。小鼠吸入异氟醚和氧气混合物进行镇静，首先采用超声二维成像观察肝脏和肿瘤，然后切换到三维模式，3D扫描参数：传感器频率21 MHz，输出功率100%，增益23～27 db，动态范围60 db，深度18 mm，3D范围27～35 mm，三维步长0.1 mm，三维扫描图像储存于硬盘中，采用Vevo lab 3.0.0软件进行后期处理。采用多切面法，绘制各切面的肝脏边界，重建肝脏三维图像，通过软件分析计算肝脏体积，然后逐帧在连续切面上识别肝脏肿瘤，测量每个病变体积。根据第10周肿瘤体积计算抑瘤率（tumor inhibition rate，TIR）=（对照组肿瘤体积-观察组肿瘤体积）/对照组肿瘤体积×100%。

1.2.3 HE染色和免疫组化染色 治疗后第10周处死小鼠取肝脏，采用10%福尔马林固定48h，然后石蜡包埋，连续切石蜡片4μm，晾干玻片后行常规HE染色和相关免疫组化染色。

1.3 统计学方法 采用SPSS23.0进行统计学数据分析，计量资料采用均数±标准差（-x±s）表示，组间采用独立样本t检验进行分析，组内比较采用重复测量数据方差分析，生存时间比较采用Log-Rank法分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAPA对HB小鼠模型肝脏体积的影响 注射第4周时2组小鼠的肝脏体积[（783.7±48.2）mm3vs（805.3±59.6）mm3]差异无统计学意义，在注射10周末观察组小鼠肝脏体积[（5 963.7±1 423.5）mm3vs（1 492.3±483.5）mm3]显著降低（P＜0.05），从7周开始观察组小鼠肝脏体积增加速度明显减慢，随着时间延长，与对照组肝脏体积差异越来越明显（图1～2）。

图1 RAPA对HB小鼠模型肝脏体积的影响

图2 RAPA对HB小鼠模型肝脏体积影响的超声三维重建图像

2.2 RAPA对HB小鼠模型肿瘤数量的影响 注射第4周时2组小鼠的肿瘤数量[（0.3±0.9）个vs（0.5±0.8）个]差异均无统计学意义，在注射10周末观察组小鼠肿瘤数量[（19.4±11.2）个vs（40.3±8.5）个]显著降低（P＜0.05）；与对照组相比较，从第7周开始，观察组小鼠肿瘤数量显著减少，且随着时间越长，与对照组小鼠肿瘤数量差异越来越明显（图3）。

图3 RAPA对HB小鼠模型肿瘤数量的影响

2.3 RAPA对HB模型小鼠肿瘤直径的影响 注射第4周时2组小鼠的肿瘤直径[（0.5±2.6）mm vs（0.9±3.1）mm]差异无统计学意义，在注射10周末观察组小鼠肿瘤直径[（45.8±23.2）mm vs（179.3±34.6）mm]显著降低（P＜0.05）；与对照组相比较，从第7周开始，观察组小鼠肿瘤直径明显减少，随着时间延长，与对照组小鼠肿瘤直径差异越来越明显（图4）。

图4 RAPA对HB模型小鼠肿瘤直径的影响

2.4 RAPA对HB模型小鼠大体形态的影响对照组小鼠在注射后第10周末因为肿瘤形成导致肝脏显著增大，肿瘤体积显著高于对照组（图5）。

图5 RAPA对HB模型小鼠大体形态的影响

2.5 RAPA对HB模型小鼠肝脏HE及免疫组化染色的影响HE染色显示，注射后第10周末，对照组肿瘤的组织学表现为密集的低分化或未分化HB；RAPA治疗组小鼠肿瘤负荷降低，肿瘤组织由分化良好的细胞组成，组织学表现类似于高良好的HB（图6）。标记外源性Δn90-β-连环蛋白的Myc标签蛋白免疫组化染色显示，对照组可见大量大小不等的myc标签蛋白阳性HB肿瘤结节，占据肝叶大部；观察组myc标签蛋白阳性HB结节数量明显减少，肝实质所占比例较大（图7）。

图6 RAPA对HB模型小鼠肝脏HE染色结果的影响（Tu代表肿瘤组织，×100）

图7 RAPA对HB模型小鼠肝脏免疫组化靶向myc标签染色结果的影响（×10）

3 讨论

HB是儿童时期常见的肝脏恶性肿瘤，占肝脏原发性恶性肿瘤的50%～60%，居儿童实体肿瘤的第3位。HB单纯手术切除效果欠佳，5年生存率仅为20%～30%。近年来随着辅助化疗的应用和手术技术的进步，HB的5年生存率已经显著提高，但HB化疗耐药和复发后的治疗仍是HB的治疗难点问题[8]。与多数儿童肿瘤一样，HB的病因、发病机制目前尚未完全阐明，目前报道约70%的HB与CTNNB1突变相关。CTNNB1基因编码β-catenin，CTNNB1突变导致β-catenin表达异常，通过MYC肿瘤蛋白活化引起细胞增殖，Wnt/β-catenin是目前广泛接受的HB致瘤信号通路，但直接抑制Wnt/β-catenin较难实现[9]。

本研究结果显示，RAPA可显著减缓HB模型小鼠肝脏肿瘤数量、肿瘤直径和肝脏体积，本研究结果证明mTOR在HB的发展中发挥重要作用。Hippo/YAP信号通路在体内控制细胞增殖和凋亡，已有研究显示，Yap表达水平在HB中呈高表达，高于在原发性肝细胞肝癌中的表达，且YAP与β-catenin共活化仅见于HB中，较少见原发性肝细胞肝癌[10]。YAP通路可激活mTOR信号通路，调控细胞生长，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。mTOR包括mTORC1和mTORC2。mTORC1控制体内多种生物学进程，其异常激活与肿瘤、心血管疾病、2型糖尿病、神经退行性病变等多种疾病相关，如在肝细胞癌中即发现mTORC1通路激活[11]。在HB细胞系中存在mTORC1的异常激活，通过YAP1-β-catenin可建立HB动物模型，mTORC1抑制剂MLN0128体外可抑制人HB细胞的生长[12]。在Yap1-β-catenin动物模型中，YAP1可上调谷酰胺转运体slc38a1表达，调节GS的表达，调节谷氨酰氨表达水平，促进mTORC1的激活[13]。YAP1也可下调mTOR的负调节因子PTEN来激活mTOR信号[14]。因此多种调节mTOR的机制共同激活可能是HB发生、发展的重要机制。

目前多种mTOR抑制剂已经被批准临床应用，体外研究显示对前列腺癌[15]、结肠癌[16]、肝癌[17]、乳腺癌[18]等多种实体肿瘤治疗有效，但因为mTOR信号通路的复杂性和存在继发耐药性，mTOR抑制剂临床应用治疗肿瘤临床效果仍存在局限性。RAPA及其类似物具有细胞抑制作用，可抑制细胞增殖，与细胞毒性化疗药物联合应用显示具有协同作用。本研究结果显示，在注射第4周时2组小鼠的肝脏体积[(783.7±48.2)mm3vs(805.37±59.6)mm3]和肿瘤大小[(0.5±2.6)mm vs(0.9±3.1)mm]均无显著差异，在注射10周末RAPA饮食组小鼠肝脏体积[(5963.7±1423.5)mm3vs(1492.3±483.5)mm3]和肿瘤直径[(179.3±34.6)mm vs(45.8±23.2)mm]均显著降低，TIR为72.69%。本研究结果提示：RAPA饮食可减缓HB肿瘤生长和细胞增殖；但经RAPA饮食干预的小鼠HB肿瘤并未完全消失，而是肿瘤负担降低。结果提示，RAPA可抑制HB细胞增殖，但不能完全杀死肿瘤，可能与HB发病涉及到多个信号通路有关，因此在RAPA治疗的同时应联合细胞毒药物化疗以进一步提高疗效。组织学观察显示，RAPA饮食干预的小鼠肿瘤组织表现分化程度较好，考虑与以下因素有关：①RAPA通过抑制mTORC1改变细胞代谢减缓肿瘤增殖，促进HB细胞分化向增殖缓慢的分化良好的HB细胞；②YAP1-βcatenin模型存在异质性，随着RAPA干预时间延长，RAPA抑制低分化HB细胞增殖，分化良好HB细胞在治疗过程中持续存在。

综上所述，本研究采用mTOR抑制剂RAPA对YAP1-β-catenin模型小鼠进行干预，结果显示RAPA可抑制HB增殖，促使HB向分化良好的组织学形态发展。