DEP结构域蛋白质1B在胰腺癌中的表达及其临床意义

李铭旭，仲成成，张功铭，胡伟,3，王仲,3

（徐州医科大学附属连云港医院 1.肝胆外科 2.病理科，江苏 连云港 222001；3.南京医科大学康达学院第一附属医院 肝胆外科，江苏 连云港 222001）

胰腺癌是最恶性的消化道肿瘤之一，是所有癌症中第四大致死原因[1-2]。胰腺癌早期症状不明显，且易侵犯血管，80%～85%的患者在诊断时已经失去了根治性切除的机会[3-4]。手术切除是唯一可能治愈胰腺癌的方法。然而，其高复发率严重阻碍了胰腺癌患者术后预后的改善[5]。早期诊断困难、肿瘤易转移和多药耐药性是导致预后不良的重要原因[6-7]。因此揭示胰腺癌快速增殖和高度侵袭的分子机制，寻找重要的相关致病因子，明确细胞内各分子间的调控机制，对胰腺癌患者的预后有重要意义。

DEP结构域蛋白质1B（DEPDC1B）位于5号染色体12.1，最早是在人类乳腺癌细胞MDA-MB231中通过mRNA表达谱发现的[8]，并进一步发现在胎盘和睾丸中表达，而在心脏和小肠中很少表达。研究发现DEPDC1B调节多种细胞活动功能，包括细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期进展及细胞骨架结构调节[9-10]。在口腔癌[11]、非小细胞肺癌[12]、前列腺癌[13]、肝癌[14]中DEPDC1B过度表达。目前DEPDC1B在胰腺癌组织中的表达及其临床意义尚未清楚。本研究通过检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库和高通量基因表达（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库，研究DEPDC1B与胰腺癌患者预后的相关性，并通过免疫组织化学方法检测和验证DEPDC1B在胰腺癌组织中的表达情况，分析其与胰腺癌临床病理特征及预后的关系，以期判断其作为胰腺癌临床预后指标的可能性。

1 资料与方法

1.1 数据集下载及整理

下载并分析了GEO 数据库中的胰腺癌队列GSE28735、GSE16515、GSE21501、GSE15471，并分析具有临床预后资料的数据集GSE28735和GSE21501。从TCGA下载胰腺癌的RNA-seq数据及临床信息。缺乏临床信息的患者被排除在外。

1.2 病例资料

选取2010—2019年连云港市第一人民医院接受手术切除的胰腺癌患者，97例患者具有完整的临床病理。其中，男性59例，女性38例；年龄37～92岁，中位年龄63岁。所有标本术后病理均证实为胰腺导管癌，高中分化66例，低分化31例。按照国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准：I～IIA期51例，IIB～IV期46例。所有入组患者术前均未接受任何针对肿瘤的治疗。

1.3 组织学检查及免疫组织化学检查

手术切除的胰腺癌与癌旁组织标本经4%多聚甲醛固定包埋在石蜡后切成4 μm厚的切片。之后切片脱水、固定并用盖玻片覆盖。根据公布的方案进行IHC试验[15]。样品与抗DEPDC1B的兔多克隆抗体一起孵育（5 g/mL稀释，PA5-72875，Invitrogen，CA，美国）。

1.4 免疫组化评分

免疫组化评分[16-17]由阳性细胞比率和染色强度组成，根据阳性细胞比率：＜25%为1 分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；将DEPDC1B表达的阳性细胞比率和染色强度相乘，阳性细胞率与染色强度之积分为0～4分为DEPDC1B阴性表达，5～12分为阳性表达；由2名病理医师采用双盲法独立评估免疫组化评分。

1.5 统计学处理

使用了R包中的“survival”、“survminer”来确定生存曲线的最佳截断值来绘制Kaplan-Meier 生存率曲线[18-19]，临床相关数据分析采用SPSS 23.0统计软件，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法，使用单因素和多因素Cox回归分析来比较DEPDC1B对预后的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 数据库分析结果

2.1.1 DEPDC1B 在胰腺癌组织中高表达通过TCGA、GEO 数据库分析DEPDC1B 在肿瘤组织和非肿瘤正常组织中的表达水平，结果显示，在TCGA、GSE16515、GSE15471、GSE28735 数 据集中，胰腺癌组织中的DEPDC1B 表达量明显高于非肿瘤正常组织，差异有统计学意义（TCGA：P=0.002；GSE16515、GSE15471、GSE28735：均P＜0.001）（图1）。

图1 在匹配的非肿瘤组织与肿瘤组织DEPDC1B 基因表达的比较 A：TCGA；B：GSE16515；C：GSE15471；D：GSE28735Figure 1 Comparison of DEPDC1B gene expressionSBetween cancer tissues and paired non-tumoral tissues A: TCGA; B: GSE16515; C: GSE15471; D: GSE28735

2.1.2 DEPDC1B 表达与胰腺癌预后的关系为进一步明确DEPDC1B 的表达与胰腺癌患者预后之间的关系，在GSE28735 数据集和TCGA 数据集中提取了有关DEPDC1B 的临床相关参数，选取最佳截断值后运用Kaplan-Meier 生存曲线进行分析。GSE28735 与TCGA 中，DEPDC1B 的低表达与良好的预后明显有关（GSE28735：P=0.032；TCGA：P＜0.001）（图2A-B），在GSE21501 中DEPDC1B 表达与胰腺癌患者预后无明显相关性（P=0.14）（图2C）。

图2 DEPDC1B 表达与胰腺癌预后的关系 A：GSE28735；B：TCGA；C：GSE21501Figure 2 Relationship between DEPDC1B expression and prognosis of pancreatic cancer A: GSE28735; B: TCGA; C:GSE21501

2.1.3 胰腺癌患者预后影响因素Cox 单因素分析发现，在TCGA 数据集中，DEPDC1B 的表达水平、年龄与胰腺癌患者预后明显有关（均P＜0.05），肿瘤分期、性别与胰腺癌患者总体生存率无明显关 系（ 均P＞0.05）； 在GSE21501 数 据 集 中， N 分期与胰腺癌患者预后明显有关（均P＜0.05），DEPDC1B 表达水平、肿瘤分期、性别与胰腺癌患者总体生存率无明显关系（均P＞0.05）。多因素分析发现，在TCGA 数据集中，DEPDC1B 的表达水平、年龄与胰腺癌患者预后的独立影响因素（均P＜0.05），肿瘤分期、性别与胰腺癌患者总体生存率无明显关系（均P＞0.05）（表1）。

表1 3 个队列总生存率影响因素的单变量和多变量分析Table 1 Univariate and multivariate analysis of the influencing factors for overall survival rates in the 3 cohorts

2.2 临床标本分析结果

2.2.1 DEPDC1B 在胰腺癌及癌旁组织中的表达通过上述数据集的结果，收集我院97 例胰腺癌患者的临床样本及数据，通过免疫组化方法进一步验证上述结果，发现DEPDC1B 主要表达于胰腺癌细胞的胞浆，DEPDC1B 蛋白的阳性表达率为69.07%（67/97）；而在癌旁组织中DEPDC1B 阳性表达率仅为11.34%（11/97），低于胰腺癌组织（χ2=62.058，P＜0.001）（图3）。

2.2.2 DEPDC1B 表达与胰腺癌临床病理特征的关系在97 例胰腺癌患者中，DEPDC1B 表达与胰腺癌分化程度、临床分期、淋巴结转移相关（P=0.031、P＜0.001、P＜0.001），而与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、神经浸润、血管侵犯及远处转移均无明显相关性（均P＞0.05） （表2）。

图3 免疫组化检测DEPDC1B 的表达（×100）Figure 3 Immunohistochemical staining for DEPDC1B expression (×100)

表2 DEPDC1B表达与胰腺癌患者临床特征的关系[n（%）]Table 2 Relations if DEPDC1B expression with the clinicopathologic features of pancreatic cancer patients [n (%)]

2.2.3 DEPDC1B 表达与胰腺癌患者预后的关系在97 例胰腺癌患者中，采用Kaplan-Meier 生存曲线发现DEPDC1B 表达与预后明显有关（P＜0.001）（图4）；Cox 单因素分析结果显示，胰腺癌组织中DEPDC1B 表达、临床分期、淋巴结转移均与胰腺癌预后有关（P=0.001、P=0.019、P=0.007），而患者年龄、性别、肿瘤大小、部位、分化程度及神经浸润与预后无关（均P＞0.05）。Cox 多因素回归分析结果显示DEPDC1B 表达、淋巴结转移是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素（HR=1.126，95%CI=1.012～1.253，P=0.029；HR=4.198，95%CI=1.105～15.954，P=0.035）（表3）。

图4 97 例胰腺癌患者中不同DEPDC1B 表达水平患者的生存曲线Figure 4 Survival curves of cases with different DEPDC1B expression levels in the 97 pancreatic cancer patients

表3 97 例胰腺癌患者预后因素的Cox 回归模型分析Table 3 Cox regression model analysis of factors in the 97 pancreatic cancer patients

3 讨 论

DEPDC1B基因包含两个重要的结构域：DEP结构域和Rho-GAP结构域[20-21]，DEP结构域在介导膜定位和调节广泛的细胞功能中起一定作用，例如确定细胞极性和测定视网膜感光细胞的高度特异度信号[22]；DEP结构域还使蛋白质能够与G蛋白偶联受体和带负电荷的膜磷脂相互作用，并介导GPCR信号通路[23]；而Rho-GAP结构域负责Rho-GAP酶信号转导[9]。DEPDC1B可以与多种信号分子相互作用，从剪接调节剂到跨膜蛋白，DEPDC1B的表达受到P53的正向调控，这是由于DEPDC1B在转录起始处与P63存在结合位点[24-25]；此外，DEPDC1B是协调有丝分裂中死亡事件和细胞周期过程所必需的[26]。在口腔癌细胞系中，DEPDC1B通过Rac1-ERK1/2信号轴促进细胞的生长、侵袭，该过程主要由Rho-GAP结构域介导[11]。 在非小细胞肺癌细胞系中，DEPDC1B通过激活Wnt/β-catenin通路来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[12]。在膀胱癌细胞系中，DEPDC1B通过调控SHC1在膀胱癌中的发生发展从而起到肿瘤促进剂的作用[27]。在胶质母细胞瘤细胞系中，小干扰RNA(siRNA)抑制内源性DEPDC1表达抑制细胞活力并且诱导细胞凋亡[28]。DEPDC1B在非小细胞肺癌[12]、前列腺癌[29]中组织中高表达，且与病理分化程度相关。本研究显示，在TCGA、GSE16515、GSE15471、GSE28735数据集中，胰腺癌组织中的DEPDC1B表达量显著高于非肿瘤正常组织；而在97例胰腺癌患者组织中DEPDC1B的表达明显高于癌旁组织，与上述结果一致，并且在低分化组中表达要明显高于高分化组，表明了DEPDC1B与胰腺癌分化程度呈正相关，提示DEPDC1B的高表达可能与胰腺癌细胞的迁移和侵袭相关。

在恶性黑色素瘤中敲除DEPDC1B抑制了恶性黑色素瘤的细胞迁移和侵袭，而在恶性黑色素瘤组织中DEPDC1B的异位表达促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭[30]。此外，在口腔癌中，DEPDC1B在培养的胚胎成纤维细胞系中诱导细胞迁移，并在口腔癌细胞系中诱导细胞侵袭[11]。胶质母细胞瘤细胞中DEPDC1B高表达可以促进上皮间质转化及增殖、侵袭[31]。笔者先前的细胞学实验发现干扰DEPDC1B表达后能抑制胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1的迁移和侵袭，过表达DEPDC1B反而起到促进作用[32]。DEPDC1B与胰腺癌临床样本的关系仍不明确，本研究发现DEPDC1B高表达与胰腺癌患者临床分期较晚（IIB～IV）、淋巴结转移相关。无论在TCGA、GSE28735数据集，还是我们97例胰腺癌样本中，DEPDC1B低表达组与高表达组相比，具有生存优势，总生存期相对延长。提示DEPDC1B可能参与胰腺癌进展，可以作为预测胰腺癌侵袭与转移的潜在指标，可能为寻找胰腺癌药物治疗靶点提供有用的信息。

本研究进一步分析来自TC G A 及GSE数据库的RNA-seq数据及临床信息，并使用Cox单因素及多因素分析，发现在TCGA数据库中，DEPDC1B表达与胰腺癌患者预后密切相关，是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素；随后对97例胰腺癌患者进行Kaplan-Meier生存分析及单因素Cox分析发现，DEPDC1B阳性表达较阴性表达患者的生存时间缩短，预后相对较差。通过Cox多因素分析发现，DEPDC1B阳性表达可以作为判断胰腺癌患者预后的独立危险因素。与上述TCGA数据库中结果一致。

综上所述，胰腺癌组织中高表达的DEPDC1B可能参与胰腺癌的发生、发展及转移过程，与胰腺癌的恶性程度、淋巴结转移及预后不良有关,并可作为判断胰腺癌预后的重要指标。