rs4379368基因突变在畲族人偏头痛中的价值及相关机制初探

吴小杨，黄艮彬，谢雯熙

偏头痛是神经内科常见疾病之一，主要临床表现为一侧或双侧搏动性剧烈头痛，呈反复发作，发作时还伴恶心、呕吐、畏光及畏声等，给病人及其家庭带来不同程度负担，生活质量严重下降[1]。在我国偏头痛患病率一般为9.3%[2]，而有关福建畲族人群流行病学调查显示其偏头痛患病率高达10.5%，考虑与其独特生活方式、文化传统及遗传背景有关[3]。迄今为止，偏头痛发病机制仍不十分明确，大量研究均提示偏头痛有明显遗传倾向及家族易感性，基因突变是其重要体现方式之一[4]。Anttila等[5]进行了1项纳入29种大规模全基因组关联研究的Meta分析，新发现了与偏头痛相关的5个基因多态位点rs4379368、rs10504861、rs10915437、rs12134493和rs13208321。本研究前期已确认rs4379368变异是福建畲族人群偏头痛的遗传风险标志物[6]，但对于其对畲族偏头痛病人的影响及诊断价值尚不明确。本研究选取300例畲族偏头痛病人和300名畲族正常人群作为研究对象，探讨rs4379368基因突变对畲族偏头痛病人的影响，并分析其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取300例畲族偏头痛病人作为病例组，入组标准：①符合国际头痛协会头痛分类委员会2004年制定的偏头痛国际标准[7]，且由两位副高级以上医师确诊；②病人及其父母亲均为畲族人；③年龄≥15岁，能清晰描述自己症状。排除标准：①合并颅内感染、脑出血、脑梗死、蛛网膜下腔出血及脑肿瘤等神经系统疾病；②其他疾病导致的头痛；③妊娠或哺乳期女性。同期选取年龄及性别与病例组匹配的300名畲族正常人群作为对照组，确认无慢性头痛病史及家族史。本研究所有研究对象均签署知情同意书，且已获得本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 抽取所有研究对象3 mL外周血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管和分离胶促凝管中，前者充分混匀后直接保存用于rs4379368基因突变检测；后者经3 000 r/min离心10 min，收集上清并保存用于脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK)和磷酸化环磷酸腺苷(cAMP)反应结合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)检测。标本保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 血清rs4379368基因突变检测 采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)检测rs4379368基因突变。第一，全基因组DNA提取：取抗凝全血解冻后加入蛋白酶K，充分混匀，后参考说明书完成全血基因组DNA提取；第二，聚合酶链式反应(PCR)扩增。①设计并合成引物，正向引物：5′-AGTGGGCTTTCATTCTGGAA-3′；反向引物：5′-AAGGGCCTGAAATCTAATTCC-3′；②反应体系20 μL，具体包括1 μL DNA模板、各0.5 μL正反向引物、12.5 μL混合物、5.5 μL 双蒸水(ddH2O)；③扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，最后在72 ℃下再延伸5 min；第三，PCR-RFLP：反应体系20 μL，包括17 μL上述PCR扩增产物，2 μL 10×Buffer和1 μL HphI限制性核酸内切酶，于37 ℃温浴1 h进行酶切，后将产物置于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并于凝胶成像仪上记录酶切结果。根据酶切图谱判断个人基因型。

1.2.3 血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平检测 采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平；取出标本解冻，参考各试剂盒操作说明书进行检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。定量资料用均数±标准差(x±s)表示，采用t检验；定性资料用构成比(%)表示，采用χ2检验；用拟合优度χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡检验；采用Spearman相关分析探讨基因型与血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 rs4379368位点PCR-RFLP结果分析 rs4379368位点PCR扩增片段长度为258 bp，经HphI内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳分离后有2个等位基因C和T，3种基因型：CC型、CT型和TT型。详见图1。

图1 rs4379368位点HphI内切酶酶切电泳图

2.2 两组等位基因和基因型分析 应用拟合优度χ2检验分析病例组和对照组基因型分布发现，病例组(χ2=0.091，P>0.05)和对照组(χ2=0.143，P>0.05)符合Hardy-Weinberg平衡规则；但两组等位基因和基因型频数分布比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组等位基因和基因型分析 单位：例

2.3 两组血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比较 与对照组比较，病例组血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比较 (x±s)

2.4 rs4379368位点基因型与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的关系 Spearman相关分析结果显示，基因型TT与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相关(P<0.05)，基因型CC与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈负相关(P<0.05)，基因型CT与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB无相关性(P>0.05)。详见表3。

表3 rs4379368位点基因型与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的关系

3 讨 论

偏头痛是一种临床常见的慢性神经血管性疾病，可发生于任何年龄，其患病率明显上升，尤以年轻女性多见[8-9]。近年来，分子遗传学发展迅速，成为偏头痛发病机制的重要热点之一[10]。本研究前期已确认福建畲族偏头痛病人存在rs4379368位点基因突变，但未进行大数据验证。本研究收集福建300例畲族偏头痛病人和300名畲族正常人群作为研究对象，发现两者等位基因和基因型频数分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中畲族偏头痛病人等位基因T和基因型TT频数分布明显高于畲族正常人群，提示T等位基因有增加畲族人群患偏头痛的风险，畲族正常人群罹患偏头痛可能是等位基因C突变为等位基因T所致，为畲族偏头痛病人诊疗提供了一个新的突破点，是本研究重要创新点之一。

偏头痛发病机制仍不明确，其中三叉神经血管学说被认为是所有学说的“头领”，其将神经、血管及递质三者完美结合，形象地解释了偏头痛的发病过程[11]。神经营养因子是神经元生长和存活所必需物质，而BDNF是神经营养因子家族重要成员之一[12]。大部分研究均提示，BDNF是中枢神经系统疼痛产生途径中重要的神经传导因子，在多种不同形式痛觉中枢敏化过程中占有重要地位[13]。Wang等[14]研究发现，头端前扣带回皮质(rostral anterior cingulate cortex，rACC)是调节慢性疼痛负性情感的关键结构，与BDNF/TrkB信号通路密切相关，而细胞外调节蛋白激酶(ERK)则是rACC中BDNF/TrkB介导信号通路的重要下游效应器，有助于神经性疼痛相关的恶性发展。此外，还有学者发现BDNF和TrkB结合后可激活ERK信号通路，使ERK磷酸化，以进一步活化cAMP反应结合蛋白(CREB)，最终使BDNF水平升高，形成循环，参与神经疼痛调节[15-16]。本研究发现，畲族偏头痛病人血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白水平明显高于畲族正常人群，提示BDNF/TrkB相关信号通路在畲族偏头痛发生过程中占有一定地位。Spearman相关分析结果显示，基因型TT与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相关，基因型CC则与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈负相关，基因型CT与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB无相关性，提示基因型TT可激活BDNF/TrkB相关信号通路，参与偏头痛发生，而基因型CC则可在一定程度上抑制BDNF/TrkB相关信号通路，阻止其向偏头痛发展。

综上所述，rs4379368位点等位基因及基因型在畲族偏头痛病人和畲族正常人群中差异明显，有一定鉴别诊断价值，其中基因型CC和基因型TT与血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB水平密切相关。