荧光法测定水溶性饮品中邻苯二甲酸酯类塑化剂含量

殷龙龙，李 群，尹 蓉，张倩茹，王 振，高忠东，许光映

（1. 山西农业大学山西功能食品研究院/特色农产品加工山西省重点实验室，山西太原 030031；2. 山西农业大学 果树研究所，山西 太原 030031）

邻苯二甲酸酯（Phthalate acid esters，PAEs） 是各类塑化剂中最常见的主要成分，被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管等数百种产品中[1]。但是，PAEs 与塑料基质分子仅仅是以氢键或范德华力相连，所以随着使用时间的增长，塑料制品中的PAEs 会不断释放出来，从而对大气、土壤和水域造成污染，更会对人类的身体健康造成潜在的危害[2]。因此，对PAEs 的检测越来越重要。

目前，检测邻苯二甲酸酯类化合物的国家标准和文献大多采用气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法、液相色谱- 串联质谱法等方法[3-4]。这些方法虽然具有严谨、准确的优点，但都需要用到大型仪器，投资大、方法时间长、操作繁琐、专业度高，适用于大中型企业或专门的检测机构，而这些方法无论在仪器价格还是在人员素质要求方面都不是小微型企业所能承受的。因此，亟待开发一种设备投资较少、操作比较简单、作业时间较短、易学易用的检测方法。选用荧光法检测PAEs，设备投资较少，操作简单、检测时间短、易学易用，适用于小微型企业，且荧光法灵敏度高、误差较小、工作曲线线性范围宽、重复性好，且能提供激发光谱、发射光谱等诸多信息。而且用荧光光谱法测定PAEs鲜见报道，其主要原因是PAEs 本身不产生荧光[5-6]。目前，李满秀等人[7]利用Fenton 反应使PAEs 生成具有荧光的羟基邻苯二甲酸钠，测定其荧光强度可间接求出PAEs 的含量。但在实际操作中，使体系荧光强度达到稳定值的条件不好控制。蔡其洪等人[8]利用PAEs 和浓硫酸反应产生荧光来间接测量PAEs 的含量。但浓硫酸对试验设备伤害较大，会减少设备的使用寿命，增加检测成本；且该方法要求被检测样品中不能含有其他有机杂质，有机杂质遇到浓硫酸会被迅速炭化变黑。因此，试验拟采用将本身不产生荧光的各类PAEs 先水解成邻苯二甲酸，再转化为可以产生荧光的物质，然后用荧光法测定该物质的含量来间接得出PAEs 的含量。物质能够产生荧光的前提是分子结构必须使具有较强电子云密度的共轭体系或者刚性平面。而邻苯二甲酸虽然是芳香族化合物，但是其分子结构带有2 个羧基，而羧基是吸电子基，会使苯环上的电子云密度降低，减弱了体系的共轭效应，故也不能直接产生荧光。为了让其产生荧光，需在邻苯二甲酸的分子结构上，特别是羧基上连接一个给电子基团。试验拟将过氧根（-O-O-） 连接到邻苯二甲酸的羧基上使其转化为邻苯二甲酸单过氧化合物来进行荧光检测。因单过氧邻苯二甲酸镁（Magnesium monoperoxyphthalate，MMPP） 是温和的氧化剂，广泛作为消毒剂和漂白剂被使用，其合成方法已经非常稳定和成熟[9-12]，且在试验中发现MMPP 在光照温暖的环境下放置一段时间后能够产生稳定的荧光。故在实际操作中以MMPP 为邻苯二甲酸转化的目标产物，并对检测条件进行一定的优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

邻苯二甲酸（99.5%，分析纯）、氢氧化钠（95%，分析纯）、氧化镁（98.0%，分析纯）、乙酸乙酯（99%，分析纯）、单过氧邻苯二甲酸镁（80%，分析纯），上海麦克林生化科技有限公司提供；盐酸（分析纯），文水县通汇科技化工有限公司提供；双氧水（30%，分析纯），天津市天力化学试剂有限公司提供；。

1.2 仪器与设备

LS45 型荧光分光光度计，珀金埃尔默仪器有限公司产品；NicoletiS5 型红外光谱仪（含ATR 附件），赛默飞世尔科技（中国） 有限公司产品；xsl-xb12030 型LED 洁净平板灯，东莞市新势力光电科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

取10 mL 5 mg/L 的MMPP 水溶液于规白色透明比色管中，在LED 灯下接受光照0.50 h，将比色管置于恒温箱中，在65 ℃下保存2 h，然后将比色管取出冷却至室温，用荧光分光光度计对比色中的溶液进行发射光强度的测定（激发光波长为290 nm，狭缝宽10 nm），发射光在波长425 nm 处产生明显的峰。针对在试验过程中对发射光强度有显著影响的3 个因素：光照时间（0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 h）、加热温度（45，55，65，75，85，95 ℃） 和静置时间（即恒温时间，分别取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）。

1.3.2 工艺优化试验说明

根据单因素试验结果设计响应曲面优化试验，由软件Design Expert.V 8.0.6 对所有影响因素与发射光强度之间的关系进行二次多元拟合，得出回归方程和最佳试验条件。

1.4 实例

分别称取单过氧邻苯二甲酸镁六水合物标准品1，2，3，4，5 mg 于5 个经过编号的1 L 容量瓶中，以去离子水定容，配置成浓度呈梯度分布的一系列MMPP 标准溶液，按照1.3.1 中的方法进行发射光强度的测定，并和标准溶液中MMPP 的含量进行线性拟合，得到MMPP 发射光强度值与含量对应关系的标准曲线和方程。

称取10 g 某品牌奶粉（取量根据最后的发射峰是否显著进行调整） 于容器中，参考毕颖等人[10]的方法制成待测滤粉，质量为MA为8.92 mg。称取5 mg 滤粉，配置成5 mg/L 的水溶液为待测溶液A。取10 mL待测溶液按照1.3.1 中的方法进行发射光强度测定，将检测结果代入标准曲线和方程，算出待测溶液A中单过氧邻苯二甲酸镁的含量，再经换算得出待测样品中所含的邻苯二甲酸酯类化合物的含量。

称取10 g 某品牌奶粉和5 mg（M0） 邻苯二甲酸二甲酯于容器中，重复上述操作配置成待测溶液B并进行荧光检测（过程中的滤饼质量MB=9.37 mg），并将待测溶液B 的检测结果与待测溶液A 的结果进行对比，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

光照时间与发射光强度的关系见图1，加热温度与发射光强度的关系见图2，恒温时间与发射光强度的关系见图3。

图1 光照时间与发射光强度的关系

图2 加热温度与发射光强度的关系

图3 恒温时间与发射光强度的关系

由图1 可知，当光照时间小于0.75 h 时，MMPP溶液的发射光强度随光照时间的增长而增大，可能是由于在此期间，随着光照时间的增长，体系在光照作用下产生的自由基越多，促进了反应的进行。当光照时间达到0.75 h 时，体系中产生的自由基达到饱和，所以其发射光强度达到最大值，且不再随着光照时间的增长而改变。

由图2 可知，MMPP 溶液的发射光强度随加热温度的升高而增大，是由于加热提供的能量促使更多的MMPP 发生反应。当加热温度达75 ℃以上时，MMPP 发射峰的峰高会骤然降低，可能是由于MMPP的苯环结构在高温下被破坏。当温度接近100 ℃，液体会因密封不严而蒸发，造成测量误差。故加热温度取75 ℃。

由图3 可知，MMPP 溶液的发射光强度随恒温时间的增长而增大，是由于在某一固定光照和温度作用下，随着恒温时间的增长，导致更多的MMPP分子发生结构变化。当恒温时间达2 h 时，所有的MMPP 分子的结构都已转化，故其发射峰的峰高会达到最大值，且不再随着恒温时间的增长而改变。

2.2 响应曲面法对检测条件的优化试验结果

根据单因素试验结果设计响应曲面优化试验。由软件Design Expert.V 8.0.6 得出的描述光照时间（h）、加热温度（℃） 和恒温时间（h） 3 个因素与发射光强度（A.U.） 之间关系的试验设计表及结果见表2，回归方程可以总结如方程（1） 所示。

响应曲面法试验设计的因素与水平设计见表1，响应曲面法试验设计表及结果见表2。

表1 响应曲面法试验设计的因素与水平设计

表2 响应曲面法试验设计表及结果

各试验因素的方差分析见表3。

表3 各试验因素的方差分析

由表3 可知只有加热温度对发射光强度有显著地影响。各因素之间的交互作用不明显。使用软件Design Expert.V 8.0.6 分析表3 中的数据，通过进行二次多元拟合，得到三组二次多元回归方程的响应面，即图4，并且得出了最佳试验条件为光照时间0.78 h，加热温度75.09 ℃，恒温时间2.5 h。

光照时间、加热温度和恒温时间对发射光强度影响的响应面图见图4。

2.3 实例结果

不同质量浓度的MMPP 标准溶液的发射光谱图见图5，标准曲线见图6。

图4 光照时间、加热温度和恒温时间对发射光强度影响的响应面图

图5 不同质量浓度的MMPP 标准溶液的发射光谱图

图6 标准曲线

在实施例中不同浓度的MMPP 标准溶液的发射光谱图如图5，根据图5 中的发射光强度得出发射光强度值与浓度对应关系的标准曲线如图6。标准方程如方程（2），待测样品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的含量C（此处以邻苯二甲酸二甲酯为代表） 可以用方程（3） 计算出来，回收率公式见方程（4）。

式中：C——表示待测样品中邻苯二甲酸二甲酯的含量，mg/g；

M——滤饼的质量，mg；

M0——向待测样品中加入的邻苯二甲酸二甲酯的质量，mg；

X——待测溶液中单过氧邻苯二甲酸镁的质量浓度，mg/L；

Y——发射光强度，A.U.。

为了便于计算回收率，假设某品牌奶粉样品中所含的塑化剂也是邻苯二甲酸二甲酯，但过氧邻苯二甲酸镁与邻苯二甲酸二甲酯的相对分子质量之比为1∶0.95。

待测溶液A 和B 的发射光谱图见图7。

图7 待测溶液A 和B 的发射光谱图

由图7 可知，待测溶液A的发射光强度YA=130.93，待测溶液B 的发射光强度YB=340.08，代入公式（2）（3） （4） 得出待测样品中邻苯二甲酸二甲酯的含量CA约为0.29mg/g，加入了5 mg 邻苯二甲酸二甲酯的样品中，邻苯二甲酸二甲酯的含量CB为0.81 mg/g，回收率为104.00%。

3 结论

对将PAEs 转化为MMPP 进行荧光测定，从而间接得出PAEs 含量的方法进行了初步研究，并通过单因素试验和响应曲面法对检测条件进行了优化，得出使MMPP 发射光强度达到最佳的反应条件为光照时间0.78 h，加热温度75.09 ℃，恒温时间2.5 h。该检测条件温和易控、检测结果准确、操作方便且成本低廉，适宜在小微型企业推广应用。但研究中还存在一些尚未明确的问题：①在H2O2的作用下MMPP转化成了什么结构，具体反应过程是什么；②研究适用于水溶性饮品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的检测，而油脂本身也可以产生很强的荧光，如何高效地检测油类产品中的塑化剂。由此可见，对邻苯二甲酸酯类塑化剂的检测和脱除有必要进行更深入的研究。