犬瘟热病毒YD株的分离鉴定及其H基因序列分析

张建普，马丽利，周利锋*

(1.河南省偃师市动物卫生监督所,河南 偃师 471900;2.上海启盛生物科技有限公司，上海 201203)

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接触性传染病。CDV属于副黏病毒科、麻疹病毒属，宿主范围广，可感染犬科、鼬科、浣熊科及多种野生动物，主要侵害易感动物的呼吸系统、消化系统和神经系统，是当前养犬业和毛皮动物养殖业危害最大的病原之一[1]。19世纪60年代以来，CDV弱毒疫苗的使用使该病得到了控制，但是近年来，世界各地相继出现了犬瘟热的暴发[2-6]。随着毛皮动物养殖业和宠物产业在我国的不断发展，犬瘟热在各地毛皮动物养殖场和宠物养殖场也常有发生，给我国经济动物养殖业造成了经济损失。CDV是单股负链RNA病毒，基因组全长15 690 nt，编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)蛋白。其中H蛋白是CDV囊膜糖蛋白，对病毒本身和宿主都非常关键。病毒感染的起始阶段需要借助H蛋白和宿主细胞受体结合来吸附于宿主细胞上；宿主针对H蛋白产生的保护性免疫反应可以阻止CDV的感染[7]。另外，H基因在6个基因中变异率最高，因此成为研究CDV变异情况的主要目的基因[8]。本试验从江苏疑似犬瘟热病犬的脾、肺和肠系膜淋巴结混合病料中成功分离了1株病毒，经鉴定该病毒为CDV强毒株，并对其H基因全长序列进行了分析。

1 材料与方法

1.1 病料

江苏某动物医院疑似犬瘟热病犬，采集其脾、肺和淋巴结。

1.2 细胞及主要试剂

表达犬淋巴细胞信号活性分子(SLAM，CD150)的Vero-SLAM细胞系由本实验室保存。细胞生长液为含7%胎牛血清的DMEM，维持液为2%胎牛血清DMEM，Gibco胎牛血清购自Life Technologies，DMEM购自北京清大天一生物技术有限公司，CDV单克隆抗体购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；羊抗鼠FITC荧光抗体购自Sigma。病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自TaKaRa公司。PCR仪购自北京鼎昊源科技有限公司，型号：DHS96G；多样品组织研磨机购自上海净信实业发展有限公司，型号：Tiss-24；荧光倒置显微镜购自OLYPUS，型号：CKX41。

1.3 参考毒株

犬瘟热活疫苗CDV-11株，购自齐鲁动物保健品有限公司。

1.4 实验动物

3月龄比格犬5只，购自上海交通大学农学院；9～10周龄水貂、10～12月龄水貂各5只，购自江苏启东某貂场；9～10周龄狐狸5只，购自上海南汇某狐场。以上动物血清CDV中和效价均小于1∶4。

1.5 病料处理

将采集的病犬的脏器剪碎，按重量加入DMEM(含有1 000 IU/mL的青霉素和1 mg/mL的链霉素)，制成10%组织悬液，用多样品组织研磨机将其研磨成匀浆，8 000 r/min 于4 ℃离心30 min，吸取上清，于-70 ℃保存。

1.6 病毒的分离培养

Vero-SLAM细胞长成单层后，接种准备好的组织上清，37 ℃吸附1 h，然后加入1%维持液，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，逐日观察，出现80%细胞病变(CPE)时收毒。同时设细胞对照。

1.7 TCID50测定

将病毒进行10倍的倍比稀释，然后接种在覆盖有Vero-SLAM细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度5孔，100 μL/孔，置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养6 d，观察CPE，按照Reed-Muench法计算CDV滴度。

1.8 间接免疫荧光(IFA)鉴定

将病毒原液进行10倍的倍比稀释，接种在覆盖有每孔2×104个Vero-SLAM细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度5孔，0.1 mL/孔，置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中，培养4 d后，弃去培养基，用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)洗涤1次，每孔加入100 μL 75%乙醇，室温固定30 min，弃去固定液，用PBS洗涤1次，自然干燥，加入1∶100稀释的CDV单克隆抗体，80 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS洗3次，每次间隔5 min，然后加入1∶200稀释的羊抗鼠荧光二抗，37 ℃作用1 h，PBS洗3次，每次间隔5 min，干燥后，在荧光显微镜下观察，出现特异性亮绿色则为阳性，反之为阴性。

1.9 血凝试验

参照《中华人民共和国兽药典》附录12，分别用1%的豚鼠、鸡、猪、人“O”型红细胞，对分离的第1代病毒进行血凝试验，检测病毒的血凝谱；同时，确定病毒感染材料中是否存在犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)或犬细小病毒(CPV)等外源病毒，此3种病毒均具有血凝性。

1.10 RT-PCR鉴定

1.10.1 引物设计和合成

根据Sanjay等[9]报道合成1对引物扩增N基因部分片段，N-F(5′-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3′)和N-R(5′-GGTCCTCTGTTGTCTTGG-3′)，预期扩增419 bp片段。参考GenBank中CDV全基因参考序列(登录号：AF378705)，利用软件Primer Premier 5.0设计1对引物扩增H基因，H-F(5′-CTCAGGTAGTCCARCAATG-3′)和H-R(5′-CCTCAGGGTATAGAATCTGGT-3′)，预期扩增2 007 bp片段。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.10.2 病毒RNA提取

按照病毒RNA提取试剂盒的产品说明书提取病毒RNA。

1.10.3 RT-PCR检测

按照RNA PCR Kit的产品说明书进行RT-PCR。

N基因PCR程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增30个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

H基因PCR程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，扩增30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.11 致病性试验

攻毒组3只犬，每只静脉接种2.0 mL，鼻内1.0 mL 分离的第1代细胞毒(104.625TCID50/mL)，对照组1只，接种DMEM细胞培养液，接种量和接种途径与攻毒组一致。观察10 d，然后剖检，采集脾、肺和肠系膜淋巴结，按照1.6所述分离病毒。按照表1安排进行试验。参考文献[10]制定临床评分系统，正常为0分；死亡为20分；与正常体温相比，变化不大于0.5 ℃记为1分，大于0.5 ℃记为2分。见表2。

表1 动物分组

表2 动物感染犬瘟热临床评分标准

1.12 H基因测序和分析

按照TaKaRa的RNA PCR Kit说明书进行RT-PCR。PCR程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，扩增30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，按照DNA纯化试剂盒说明书回收目的条带，由上海生物工程有限公司测序。使用DNAStar 7.1对测得H基因序列进行比对分析，NetNGlyc 1.0 对推导的氨基酸序列进行分析，使用Mega 5.02绘制系统发生树。

表3 参考基因序列

2 结果

2.1 病毒的分离

在Vero-SLAM细胞上接种病料组织悬液，48 h出现合胞体、细胞溶解、胞浆空泡化、细胞脱落等细胞病变(CPE)(见图1)。测定第1代细胞毒滴度为104.625TCID50/mL。

2.2 间接免疫荧光鉴定

感染分离病毒的Vero-SLAM细胞有特异性绿色荧光，对照细胞无荧光(见图2)。

A． 接种病料的Vero-SLAM细胞；B.细胞对照图1 Vero-SLAM细胞接种病料组织后的形态变化(100×)

A.感染分离病毒后的Vero-SLAM细胞；B.细胞对照图2 IFA鉴定结果(200×)

2.3 血凝谱和外源病毒检测

分离病毒不能凝集豚鼠、鸡、猪、人“O”型红细胞，说明分离株无血凝活性，且病毒感染材料中无CAV、CPV和CPIV。

2.4 RT-PCR鉴定

通过1%琼脂糖电泳，分离病毒RT-PCR产物大小为419 bp，与预期相符(见图3)。

M.100 bp DNA Marker；1.CDV YD株；2.阳性对照图3 N基因RT-PCR扩增结果

2.5 对不同动物的致病性

接种分离病毒后第5～7天，动物开始出现体温升高、精神沉郁、食欲减退、鼻镜干燥、眼鼻有浆液性分泌物等症状，观察至21 d，未见神经症状。1号狐狸于攻毒后第8天患急性犬瘟热死亡。第21天剖检可见肠系膜淋巴结肿大，小肠黏膜出血，肺脏肉变，出血，脾脏肿大，出血等病变。攻毒后第4天开始可以从粪便和鼻拭子中检测到CDV。对照组未观察到异常症状和病理变化。临床累计得分表明，攻毒组动物得分明显高于对照组，说明攻毒组动物均出现犬瘟热症状。详情见表4。以上结果鉴定分离的病毒为CDV，命名为YD株。

表4 分离病毒攻毒后动物21 d评分累计结果

2.6 H基因测序和分析

利用H基因特异性引物，经PCR扩增后获得大小为2 007 bp的片段，与预期大小相符(见图4)。YD株H基因仅含有1个ORF，全长1 824 bp，编码607个氨基酸。YD株H基因与强毒株核苷酸同源性为92.8%～99.7%，氨基酸同源性为93.0%～99.7%，与国内强毒株核苷酸同源性较近，为98.4%～99.7%，而与疫苗株核苷酸同源性较远为91.2%～91.5%，氨基酸同源性为90.3%～91.2%。利用Mega 5.02绘制系统发生树(见图5)。从系统发生树中可以看出，CDV分为两大分支，疫苗株和野毒株，后者分5个基因型，YD株与国内野毒株在一个大分支中，属于国内流行基因型Asia-1型。此外，CDV YD株推导的H蛋白氨基酸中有保守的12个半胱氨酸(Cys)残基，9个潜在天冬酰胺连接(N-)糖基化位点，分别在第19～21、149～151、309～311、391～393、422～424、456～458、584～586、587～589、603～605位(见图6)。

1.阴性对照；2.阳性对照；3.CDV YD株；4.DNA 分子量标准(DL 1000)图4 H基因RT-PCR扩增结果

图5 CDV H基因核苷酸序列的系统进化树

注：阴影部分为潜在N连接糖基化位点(N-X-S/T)；▼为Cys位点图6 CDV 不同分离株H蛋白氨基酸序比对分析

3 讨论

CDV对外界环境的抵抗力差，其脂质囊膜结构易被光、热破坏，导致病毒灭活，使得病毒分离成功率较低[3]。因此，临床组织病料采集时尽量处于低温环境，采集后尽快低温保存，这样才能使病毒在接种细胞前不被灭活。另外，采样的部位、时间、样品处理、病程类型、病犬的抗CDV抗体水平等因素都对病毒的分离有一定的影响，但最主要的因素是分离CDV所选细胞是否敏感。Vero-SLAM细胞可以表达犬淋巴细胞信号活性分子(SLAM，CD150)，CDV感染细胞时通过识别SLAM进入细胞进行复制[11]，大大提高了CDV的感染效率，并且感染后的细胞会出现明显的CPE，便于进行病毒分离和滴度测定。病料组织在接种Vero-SLAM细胞48 h后，出现了与CDV疫苗株相同的变化，如细胞溶解、胞浆空泡化、合胞体等CPE，测定分离病毒第1代细胞毒滴度为104.625TCID50/mL。分离的病毒不凝集豚鼠、猪、鸡和人“O”型红细胞，一方面说明该病毒无血凝性，另一方面说明该病毒材料不含CAV、CPV或者CPIV，通过间接免疫荧光检测证明该病毒为CDV。通过RT-PCR鉴定可以扩增到419 bp的目的条带，与CDV疫苗株一致。犬、水貂、狐狸接种分离毒株后5～7 d开始出现犬瘟热症状，并可以监测到感染动物排毒。对动物的致病性试验也为不同动物的CDV攻毒模型的建立提供一定的参考。以上结果均符合犬瘟热病毒特点[12]，证明分离的病毒是犬瘟热病毒。

CDV主要分为7个基因型，Asia-1、Asia-2、Europe、Europe Wildlife、vaccine(America-1)、America-2、Arctic[12]，另外，近几年一些地区出现了新的病毒谱系，预示着它们可能是新的基因型，例如Africa、Asia-3、Argentina和America[13-17]。H基因系统发生树结果表明，CDV具有地理性分布现象，YD株与国内的毒株同源性较高组成一个系，欧美和日本各成一个系。另外，其分布与宿主无关，进化树中不同宿主来源的毒株均成随机分布。这些结果与其他学者报道一致[18-19]。蛋白质糖基化程度可能影响病毒的抗原性，CDV H蛋白潜在的N连接糖基化位点不同可能会破坏重要的中和相关表位位点[20-22]。目前最常用的疫苗株是Onderstepoort和Convac，两者的N连接糖基化位点分别是6个和7个，而野毒株为8个或9个，其中309～311位(H蛋白位置)为野毒株特有。这些遗传差异可能是近年来暴发犬瘟热的重要原因[23]。YD株H蛋白中有9个潜在的N连接糖基化位点(N-X-S/T)，与国内大多数野毒株相同，而第584～586位为国内毒株所特有。CDV H蛋白中天冬氨酸(Cys)对该蛋白成熟过程的正确折叠是必要的[24]，YD株H蛋白中可见12个保守的Cys残基，且所在位置均与其他毒株相同。

综上所述，本试验从病犬组织中成功分离到1株CDV强毒株；H基因测序分析显示，该毒株属于Asia-1型。研究结果为当前中国CDV毒株变异情况提供了参考，为疫苗研发奠定了基础。