饲粮蛋白质水平对广丰山羊肉品质、血清酶活性、瘤胃发酵和肠道发育的影响

2021-04-13占今舜占咏平李文杨霍俊宏

动物营养学报 2021年3期

占今舜刘远占咏平李文杨霍俊宏**

(1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，南昌330200；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；3.玉山县畜牧兽医局，上饶334700)

饲粮中的植物性蛋白质和非蛋白氮在瘤胃微生物的作用下生产肽和氨基酸以及合成微生物蛋白供宿主利用。因此，饲粮中的蛋白质水平和蛋白质饲料种类、结构等会改变瘤胃微生物菌群结构，影响瘤胃的消化和代谢，进而影响反刍动物的生产性能[1]。张凯凯等[2]研究发现，18.99%蛋白质水平组贵州黑山羊羔羊体重、平均日增重和体尺指标等均优于15.01%、17.02%及20.99%蛋白质水平组。施安等[3]研究发现，用蛋白质水平为28.17%的饲粮饲喂滩寒杂种羔羊，其生产性能和经济效益高于蛋白质水平为13.10%、18.51%、23.84%的饲粮。Estrada-Angulo等[4]研究发现，在试验前期，羔羊的生长性能和能量利用率随着饲粮蛋白质水平的升高而显著升高，但试验后期，饲粮蛋白质水平超过110 g/kg对生长性能和能量利用率无显著影响。Chobtang等[5]研究发现，山羊的末重、平均日增重和粗蛋白质消化率随着全混合日粮蛋白质水平的升高而显著升高。以上结果表明，适宜的饲粮蛋白质水平能够提高肉羊的生产性能，增加经济效益。广丰山羊是一种原产于江西省广丰区的地方山羊品种，分布于江西省玉山、上饶等地。广丰山羊全身被毛白色，体型偏小，能够适应当地低山丘陵环境，具有耐粗饲、抗病力强、繁殖力强和采食能力强等优点[6]。目前，广丰山羊饲养方式比较粗放，生产效率低。关于广丰山羊营养研究方面尚未见报道。因此，本试验拟开展饲粮蛋白质水平对广丰山羊肉品质、血清酶活性、瘤胃代谢和肠道发育的影响研究，为今后合理配制广丰山羊饲粮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲养管理

2019年9月在江西省龙海农业开发有限公司广丰山羊原种场开始试验，试验期分预试期和正试期，其中预试期14 d，正试期70 d。试验选择3月龄左右、健康且体重相近[(10.15±0.83) kg]的广丰山羊30只，随机分为3组，每组10只(公母各占1/2)，公母分栏饲养。每组山羊分别饲喂高(H组)、中(M组)和低蛋白质水平(L组)的精料，粗料均为铡碎的山上野生芒草鲜草。芒草的营养成分(绝干基础)检测结果为：粗蛋白质7.44%、粗脂肪3.90%、粗灰分8.07%、中性洗涤纤维77.83%和酸性洗涤纤维49.19%。参考《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)来配制饲粮，其中H组和L组精料蛋白质水平分别是M组的1.2和0.8倍，精料组成及营养水平见表1。将鲜草铡碎，然后以精粗比50∶50混合拌匀，在每天的08:30和17:30进行饲喂，自由采食，自由饮水。其他饲养管理按照原种场的规定进行。

表1 精料组成及营养水平(干物质基础)

1.2 肉品质测定

整个试验期结束后，每组选择4只山羊(公母各占1/2)进行屠宰。取出山羊第11～13肋骨处的背最长肌，用于测定肌肉的pH、熟肉率、失水率和剪切力等指标，参照占今舜等[7]方法测定，由福建省农业科学院畜牧兽医研究所草食动物研究室完成。

1.3 血清采集和指标测定

在正试期的第14、35和70天晨饲前，每组选择8只山羊(公母各占1/2)颈静脉采血。采集的血液样品在室温下静置2 h，再用离心机3 500 r/min离心10 min收集血清。测定的指标有谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用比色法进行测定，由北京华英生物技术研究所完成。

1.4 瘤胃液采集和指标测定

试验结束后，每组选择4只广丰山羊(公母各占1/2)立即屠宰，取出瘤胃，按照占今舜等[8]方法采集瘤胃液，瘤胃液的pH用便携式pH计测定。

1.4.1 瘤胃液挥发性脂肪酸含量的测定

取5 mL瘤胃液，12 000 r/min离心20 min，取上清液1.5 mL。将上清液与0.15 mL 25%偏磷酸混匀后静置30 min，然后12 000 r/min离心15 min，取上清液待测。挥发性脂肪酸含量用气相色谱仪(GC-148，日本岛津)进行测定，方法如下：色谱柱采用毛细吸管柱(34292-07B，NUKOLTM Capillary Column，30 m×0.32 mm×0.25 μm)，柱温130 ℃，汽化温度180 ℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180 ℃，以氮气为载气。

1.4.2 瘤胃液氨态氮含量的测定

取6 mL瘤胃液，15 000 r/min离心20 min，取上清液40 μL，然后与2.5 mL苯酚显色剂和2.0 mL次氯酸盐试剂混合，旋涡振荡混匀后在37 ℃水浴中显色30 min。最后用酶标仪测定550 nm处吸光度[9]。

1.4.3 瘤胃液细菌基因表达的测定

吸取200～400 μL瘤胃液到2 mL离心管中，用天根生物科技有限公司生产的粪便基因组提取细菌DNA，提取方法参照试剂盒中的说明书进行。根据Zhan等[10]研究中的序列进行细菌引物的合成，引物由Invitrogen公司合成(表2)。采用实时荧光定量PCR进行基因相对表达的检测，实时荧光定量PCR方法和操作步骤参照天根生物科技有限公司生产的试剂盒中的说明书。检测由福建省农业科学院畜牧兽医研究所草食动物研究室完成。

表2 实时荧光定量PCR引物

1.5 肠道组织的测定

屠宰后，准确找到山羊十二指肠、空肠和回肠，然后用4%多聚甲醛固定用生理盐水将内容物冲洗掉的肠道组织。根据占今舜等[7]的方法制成切片。在显微镜下检测肠道绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，并计算绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)。

1.6 数据统计

以总细菌基因为内参基因，用2-ΔΔCt方法来计算细菌基因相对表达量。数据先用Excel 2016预处理，再采用SPSS 21.0软件one-way ANOVA进行方差分析，LDS法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示。P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肉品质的影响

从表3中可知，H组的山羊肌肉pH45 min显著高于L组(P<0.05)，而熟肉率则显著低于L组(P<0.05)，其他指标各组间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肉品质的影响

2.2 饲粮蛋白质水平对广丰山羊血清酶活性的影响

从表4中可知，整个试验期，M组的血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶的活性均低于其他2组，但各组间差异不显著(P>0.05)。

表4 饲粮蛋白质水平对广丰山羊血清酶活性的影响

2.3 饲粮蛋白质水平饲粮对广丰山羊瘤胃发酵的影响

从表5中可知，M组的瘤胃液pH低于其他2组，而瘤胃液氨态氮含量则高于其他2组，但各组间无显著差异(P>0.05)。L组的瘤胃液乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的含量显著高于H组(P<0.05)，其他指标各组间无显著差异(P>0.05)。

2.4 饲粮蛋白质水平对广丰山羊瘤胃细菌基因表达的影响

从表6中可知，M组山羊瘤胃黄色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃杆菌基因相对表达量极显著高于其他2组(P<0.01)，其他2组间无显著差异(P>0.05)；H组溶纤维丁酸弧菌基因相对表达量极显著高于其他2组(P<0.01)，其他2组间无显著差异(P>0.05)；产琥珀酸丝状杆菌基因相对表达量随饲粮蛋白质水平下降呈极显著降低(P<0.01)；H组栖瘤胃普雷沃菌基因相对表达量极显著低于其他2组(P<0.01)，其中M组相对表达量最高；L组白色瘤胃球菌基因相对表达量极显著低于其他2组(P<0.01)，其中M组相对表达量最高。

表5 饲粮蛋白质水平对广丰山羊瘤胃发酵的影响

表6 饲粮蛋白质水平对广丰山羊瘤胃细菌基因表达的影响

2.5 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肠道发育的影响

从表7中可知，L组山羊回肠的绒毛高度显著高于H组(P<0.05)，而隐窝深度和VH/CD组间无显著差异(P>0.05)；L组空肠绒毛高度和VH/CD极显著高于H组(P<0.01)，显著高于M组(P<0.05)，而隐窝深度组间无显著差异(P>0.05)；各组间十二指肠绒毛高度、隐窝深度和VH/CD均无显著差异(P>0.05)。

表7 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肠道发育的影响

3 讨论

3.1 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肉品质的影响

pH是反映肉羊宰杀后肌糖原酵解速度和强度的重要指标，它是影响肉品质主要指标之一。据报道，肉羊屠宰后，pH为6.0～7.0，肌肉放置1 h后，pH降至5.4～5.6[11]。本试验结果发现，肌肉pH为6.0～6.4，比较正常。饲粮营养水平能够影响肌肉pH，李宏等[12]研究发现，随着营养水平的升高，羊肉pH45 min升高。本试验研究结果与其相似，说明提高饲粮蛋白质水平能够提高羊肉pH。肌肉的失水率越低，熟肉率越高，肉的保水性越好，说明肉品质越好。剪切力是表示肌肉嫩度的一个指标，剪切力越大，嫩度越小，反之则嫩度越大[13]。闫秋良等[14]研究发现，饲喂低蛋白质水平饲粮的东北肉用细毛羊的熟肉率显著高于饲喂高蛋白质水平饲粮，而蛋白质水平对失水率和剪切力无显著影响。本试验结果与其相似。马铁伟等[15]研究发现，随着饲粮蛋白质水平提高，湖羊肌肉失水率显著降低，而熟肉率无显著变化。施安等[3]研究发现，饲粮蛋白质水平对滩寒杂种羔羊的熟肉率、失水率和剪切力均无显著影响，其中失水率随着饲粮蛋白质水平的提高而升高。结合本研究结果，表明低蛋白质水平饲粮能够提高肉羊肌肉的保水力，但不会影响肌肉嫩度。

3.2 饲粮蛋白质水平对广丰山羊血清酶活性的影响

机体血液生化指标能够反映机体营养物质的代谢情况，通过检测血液生化指标能够间接反映机体的健康状况[16]。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映肝脏功能的2个重要指标，它们在氨基酸降解过程中发挥重要作用。正常情况下，血清中谷草转氨酶活性较低，当肝脏细胞受损时，会使谷草转氨酶和谷草转氨酶/谷丙转氨酶明显升高，说明肝脏受到损伤[17]。郭万正等[18]研究发现，马头山羊血清谷丙转氨酶活性随着全混合颗粒饲粮蛋白质水平的降低而显著降低，谷草转氨酶/谷丙转氨酶显著升高，但谷草转氨酶活性无显著影响。结果表明，饲粮蛋白质水平能够影响山羊血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性。机体粗蛋白质含量过高，会造成肝脏代谢负担加重，导致谷草转氨酶活性升高，而营养不良等情况也会导致谷草转氨酶活性升高[18]。本试验来看，摄入高蛋白质可能造成肝脏代谢负担加重，促使谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性升高，而摄入低蛋白质可能由于营养不足而造成谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性升高。结果表明，饲粮蛋白质水平过高或过低均可能会影响肝脏功能。碱性磷酸酶是一种消化代谢过程中的关键性酶，可反映动物的生长性能。动物在健康状态下，碱性磷酸酶活性增加有利于物质代谢，增加动物平均日增重[19]。在本试验中，除正试期第70天外，高蛋白质组的血清碱性磷酸酶活性均高于其他组，说明饲粮高蛋白质水平有利于动物生长。碱性磷酸酶也是检测肝脏功能的一个重要指标，如果肝脏受损，会导致该酶活性升高。在本试验中，试验后期，低蛋白质水平组山羊血清碱性磷酸酶活性升高，可能是因为山羊长期摄入蛋白质不足导致肝脏受损造成的。

3.3 饲粮蛋白质水平对广丰山羊瘤胃发酵的影响

饲粮中的纤维、淀粉等物质被瘤胃内微生物发酵，生成主要供能物质——挥发性脂肪酸。饲粮的组成和比例能够影响瘤胃微生物的多样性，进而影响瘤胃挥发性脂肪酸的生成[20]。司丙文等[21]研究不同蛋白质水平饲粮对羔羊瘤胃发酵的影响，结果发现，瘤胃pH和氨态氮含量随饲粮蛋白质水平的升高而显著升高，但乙酸/丙酸没有显著变化。10.4%蛋白质组羔羊瘤胃总挥发性脂肪酸含量显著高于13.0%和15.7%蛋白质组。田梅等[22]研究发现，高蛋白质水平组瘤胃pH和乙酸含量显著低于低蛋白质水平组，而丙酸含量则显著高于低蛋白质水平组。夏永波等[23]研究发现，21%蛋白质组山羊瘤胃氨态氮含量显著高于15%和17%蛋白质组，19%蛋白质组瘤胃总挥发性脂肪酸含量显著高于其他组，15%蛋白质组最低；21%蛋白质组瘤胃乙酸含量显著高于15%蛋白质组，而丁酸含量则显著低于15%蛋白质组。本试验发现，低蛋白质水平组的乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸含量显著高于高蛋白质水平组。以上结果表明，饲粮蛋白质水平能够影响瘤胃发酵。大部分挥发性脂肪酸主要由碳水化合物产生，当饲粮中易发酵的碳水化合物增多时，挥发性脂肪酸也增多[24]。本试验中，低蛋白质水平组的挥发性脂肪酸含量要显著高于高蛋白质水平组，可能是因为高蛋白质水平组饲粮中易发酵的碳水化合物相对减少，导致挥发性脂肪酸产生降低。

白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和产琥珀酸丝状杆菌等是纤维素降解相关的细菌。栖瘤胃普雷沃氏菌、溶纤维丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃杆菌是研究最多的主要降解饲粮蛋白质的细菌[25-26]。牛骁麟等[27]研究发现，白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌含量随饲粮蛋白质水平降低而降低，中蛋白质水平组产琥珀酸丝状杆菌、黄化瘤胃球菌和普雷沃氏菌含量高于其他2组。本试验结果与其相似。从本试验结果来看，饲粮高蛋白质水平利于瘤胃溶纤维丁酸弧菌和产琥珀酸丝状杆菌的生长，中蛋白质水平有助于促进白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉瘤胃杆菌的生长。高蛋白质和低蛋白质水平组瘤胃白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉瘤胃杆菌数量下降，原因可能是饲粮蛋白质水平过高或过低，会促进这些细菌发生竞争、拮抗细菌的生长，进而抑制其生长。

3.4 饲粮蛋白质水平对广丰山羊肠道发育的影响

小肠是机体营养物质消化和吸收的主要场所，绒毛长度、隐窝深度是反映肠道黏膜吸收功能的重要指标[28]。肠绒毛能够扩大营养物质的吸收面积，较高的VH/CD有利于营养物质的吸收，而绒毛变短，会减少营养物质的吸收，降低动物的生长性能[29]。隐窝深度能够反映隐窝细胞的增殖率和成熟度。隐窝越深，说明细胞成熟度下降，消化酶的合成和分泌下降[30]。而隐窝越浅，细胞成熟度越好，肠上皮细胞分泌消化液的能力增强，进而加强化学消化功能[7]。祁敏丽[31]研究发现，降低蛋白质水平能够显著降低湖羊十二指肠的VH/CD、空肠绒毛高度、空肠的VH/CD。这说明饲粮蛋白质水平能够影响肠道组织形态，进而影响肠道的消化吸收功能。饲粮蛋白质抗原能够引起细胞介导的超敏反应，造成肠道组织损伤、绒毛变短和隐窝增生，进而导致肠道吸收功能降低[32]。研究发现，饲粮蛋白质水平降低能够改善小肠结构，这可能是因为降低蛋白质水平导致抗原水平也降低[33]。在本试验中，高蛋白质水平组山羊回肠的绒毛高度、空肠绒毛高度和VH/CD显著低于低蛋白质水平组，这可能跟高蛋白质水平饲粮的蛋白质抗原高有关。