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健神利水方对脑出血大鼠水通道蛋白AQP-4表达的影响

2021-04-13高玉广黄德庆何乾超刘永辉莫穷泽张元侃邓海霞黄树武

中国民族民间医药 2021年5期
关键词:利水脑水肿含水量

高玉广 黄德庆 刘 泰 何乾超 刘永辉 莫穷泽 张元侃 邓海霞 黄树武

广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023

血脑屏障,主要由脑微血管内皮细胞、基底膜和星形胶质细胞构成,存在于脑组织和血液之间的屏障结构。脑出血患者发生血脑屏障功能异常,内环境紊乱,血液中的多种物质进入大脑,侵袭大脑组织,血肿周围水肿在3小时到7天内可持续增加,是脑出血后的重要病理改变[1-3]。因此,保护血脑屏障功能在脑出血治疗中尤为重要。水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是疏水性蛋白,其中水通道蛋白4(AQP-4)是脑组织内最重要的水通道蛋白,可维持脑内水平衡。脑组织里的AQP-4大多数存在于血脑屏障的星形胶质细胞膜表面,其介导水进出脑组织。血脑屏障破坏后,AQP-4表达异常,脑组织水代谢障碍,引起脑水肿[4-5]。研究[6]表明caveolin-1在脑出血后的表达发生了上调,认为caveolin-1在脑出血早期的脑损伤中发挥的是破坏性的角色,前期研究表明,健神利水方可以减少实验性脑出血大鼠caveolin-1表达[7-8],可以减少脑出血大鼠神经功能损害及脑含水量[9],为了深入研究,本课题拟通过动物实验,采用胶原酶制作脑出血大鼠模型,模拟脑出血发展过程,观察脑含水量和AQP-4表达水平,同时观察健神利水方对脑出血大鼠AQP-4表达的影响,探讨健神利水方治疗脑出血分子机制;为脑出血的治疗靶点提供证据,为中医药治疗脑出血提供科学依据,具体汇报如下。

1 资料与方法

1.1 动物及实验材料 实验动物:清洁级健康20月龄雌性SPF级大鼠160只,采购来源于长沙市天勤生物技术有限公司(许可证号:SCXK湘2019-001)。主要实验试剂及药物:AQP-4抗体(Abcam,lot:ab128906),Western blotting 一抗稀释液(biosharp,lot:70015829),胶原蛋白酶(美国Sigma公司,lot#50190619),内参Anti(biosharp,lot:69070015),ECL化学发光试剂盒(biosharp,lot:69070015,BL523A),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X(biosharp,lot:69078121c)。健神利水方组方(丹参15 g、茯苓15 g、三七粉3 g、猪苓15 g、泽泻10 g、白术10 g、桂枝6 g)[一方药业有限公司]。实验器械:脑立体定位仪(成都仪器厂,ST-4ND),5 μL、100 μL微量注射器,电子分析天平(奥豪斯仪器常州有限公司,型号AR224CN),组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司,型号:KZ-III-F),发光凝胶成像仪(美国 Alpha公司,型号:fluorChem E)

1.2 研究方法

1.2.1 脑出血大鼠模型 脑出血模型:大鼠术前4 h禁水、禁食,采用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,将大鼠放置于立体定位仪上,保证前囟和后囟在同一水平面,按照Gary等[10]的造模方法,于前囟后1 mm,右侧 3 mm 处(即为右侧尾状核的位置)钻一直径约1 mm 的小孔,使用立体定位仪上的微量注射器进针6 mm,在 10 min 内注射胶原酶Ⅶ0.5 U,注射结束后停针 5 min,缓慢退针。

脑出血模型建立成功的评价:参照Matsushita等的研究[11],对苏醒后的大鼠进行动物行为学评定(4分——不能行走;3分——偏向对侧倾倒;2分——向瘫痪侧转圈;1分——不能完全伸展对侧前爪;0分——无神经损伤症状),功能≥2 分的动物表示造模成功,入选本实验,<2分的被剔除,并补充实验动物,达到各组所需的总数量。

假手术模型:以等量生理盐水代替胶原酶,建立方法同胶原酶脑出血模型。

1.2.2 分组及造模 实验动物和分组:以人60岁为老年年龄,大鼠对应鼠龄则为20个月,取160只取20~22月龄成年雄性SD大鼠,体重300±35 g,分别两次采用SPSS18.0产生随机序列。第一次随机分出空白组(n=40,不予任何处理)、假手术组(n=40,注射等剂量生理盐水)以及脑出血组(n=80,注射胶原酶制备脑出血模型),在脑出血模型建立后再次分别进行随机分组:A:模型组,B:健神利水组,每组40只,以避免分组后再进行造模,从而增加偏倚的风险。

1.2.3 干预方法 造模后,空白组仍不予任何处理,假手术组予生理盐水灌胃,模型组予生理盐水灌胃,健神利水组给予健神利水方灌胃,临用按《现代医学实验动物学》进行换算,每次按380 mg/kg配成新鲜灌胃液,每日2次,持续7 d。

1.2.4 取材及处理 取相应时间点6 h、24 h、3 d、7 d的大鼠,麻醉后,开胸,将钝头灌注针沿心尖插入主动脉,用止血钳固定针头,剪开心耳后,用生理盐水快速灌注冲洗,持续到流出没有血水的液体、大鼠上肢苍白为止,随后换4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注固定,固定时多聚甲醛溶液的速度先快后慢,直至大鼠僵硬如板状,打开颅腔迅速取脑,再根据免疫印迹法检测要求而制作相应标本以供保存。

1.3 观察指标

1.3.1 脑组织含水量测定 麻醉大鼠,断头处死,迅速取出脑组织,立即称湿重。将组织放入烘干箱100烘烤24 h再称干重。按Elliot公式计算脑组织水含量:脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.2 免疫印迹(Western blot)检测AQP-4的表达水平 脑组织置 0.5 mL 印迹缓冲液。超声波匀浆,置于1.5 mL离心管中,电动组织研磨棒进行组织研磨,进入蛋白裂解液,裂解5分钟后于4 ℃,1000 rpm,离心10 min,去沉淀组织,留取上清液。测出各样本的蛋白质浓度。然后电泳,分离胶浓度8%,每泳道加入50 μg蛋白样品。待溴酚蓝到达分离胶底部后,进行转膜。转膜完成后,将PVDF膜后置于含5%脱脂奶封闭液室温封闭1小时,加入一抗,4 ℃孵育过夜。次日用WB洗涤液洗PVDF膜3次后,加入二抗,室温孵育1 h。WB洗涤液洗PVDF膜3次后加入3 mL化学发光溶液(ECL),随即进行光敏胶片显像。用Imag J图像分析系统测定蛋白信号的灰度值,β-Actin作为内参蛋白并对蛋白相对表达量进行统一处理。

1.4 统计学方法 使用统计软件MedCalc15.2.2进行统计分析,正态分布的计量资料,两组组间比较,采用t检验,三组组间比较采用方差分析;非正态分布计量资料组间比较采用非参数法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 研究结果

2.1 各组脑组织含水量比较 空白组、假手术组未出现脑组织含水量变化,其余各组脑组织含水量从6 h时起均逐渐增多;模型组和健神利水组于3 d时脑组织含水量达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点脑组织含水量均低于模型组(P<0.05)。详细见表1、图1。

表1 各组大鼠脑组织含水量比较

图1 各组大鼠脑组织含水量比较

2.2 各组AQP-4的表达水平比较 空白组、假手术组未出现AQP-4上调,其余各组AQP-4从6 h时均逐渐增高上调;模型组和健神利水组于3 d时AQP-4表达值达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点AQP-4表达低于模型组(P<0.05)。详细见表2、图2、图3。

表2 各组大鼠各个时间点AQP-4表达

图2 各组AQP-4不同时间点表达趋势图 图3 各组AQP-4各时间点表达图

3 讨论

脑出血是常见的脑血管疾病,常由高血压所致,脑出血常伴随出现原发性血肿,预后的康复治疗往往与血肿大小及位置相关,同时脑出血并有脑水肿出现[12]。脑出血属于中医领域的“中风”范畴,Front Pharmacol以及Chin J Integr Med杂志刊登的两项研究[13-14]表明,中药通过多靶点、多途径的方式治疗脑出血,改善脑出血的症状。广西名中医刘泰教授等基于祖国医学理论、动物实验、临床研究结论,认为脑出血主要机制关键为 “脑内蓄血”及“瘀水内阻”引起脑失其司知觉,出现偏瘫、失语,健神利水方是由经方五苓散加三七、丹参化裁而成,该方以君药泽泻之甘淡直达肾与膀胱之所,利水渗湿;臣药茯苓、猪苓之淡渗助泽泻增强利水渗湿之功;佐药白术、茯苓健脾利水;加三七通脉行瘀,止血不留瘀,丹参养血活血,改善脑循环,具有温阳化气、利水行瘀的作用,适用于脑出血伴脑水肿患者[7,9]。

AQP-4的表达在脑部水肿区的明显增多,因此Previch LE等[4-5]认为上调的AQP-4参与了脑水肿的形成。本项目研究结果显示,实验性大鼠在脑出血后脑含水量不断升高(6 h至3 d时间段),而此时间段的AQP-4的表达也随着脑含水量的升高而升高,AQP-4表达值与脑含水量成正相关的关系,也与Previch LE的研究结果相一致,脑水肿发生与AQP-4密切相关。健神利水方可以减少脑出血大鼠神经功能损害及脑含水量,在本实验研究中,健神利水组的各个时间点的脑组织含水量低于模型组,与此同时,健神利水组各个时间点的AQP-4表达低于模型组,可以得出结论:健神利水方可以减少脑出血大鼠脑组织含水量,可抑制AQP-4表达。

AQP-4表达值与脑含水量关系密切,原因在于脑组织的AQP-4主要分布于血脑屏障,当脑出血发生后,血脑屏障受损,内环境发生紊乱,血肿AQP-4大量聚集,周围产生炎性水液,水通道异常,引起脑水肿,是脑出血后的重要病理基础[15-16]。本实验研究表明:脑出血后,脑组织含水量增多,AQP-4表达增多;健神利水方可以减少脑出血大鼠脑组织含水量,可抑制AQP-4表达,一方面揭示了脑出血相关的分子机制,另一方面也为健神利水方治疗脑出血提供了实验依据。

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