一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

2021-04-13张智明李建华何世岷

饲料博览 2021年3期

方超，张智明，李建华，何世岷

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

猪流行性感冒简称猪流感（Swine influenza，SI），是由A 型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病，主要临床症状为咳嗽、打喷嚏、发热、趴卧、食欲减退等[1-4]。猪流感的发病率极高，且传染性强，很难切断传播途径，一旦感染在短时间内可波及全群，对猪的生长性能造成不良的影响。单纯感染猪流感时死亡率并不高，但若与其他病原混合感染会使死亡率骤增，给养猪业造成严重的经济损失[5-8]。猪流感病毒的流行存在地域性，易发生变异，且具有数十种亚型。猪流感的流行特点导致免疫接种是目前防控该病的唯一有效手段，因此从发病现地分离病毒并制备疫苗对该病的防控尤为重要[9-10]。

1 材料

疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品8份，某猪场现地采集；HI 效价为1∶640 的猪流感病毒H1 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶640 的猪流感病毒H3 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶320 的猪流感病毒H5 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶320的猪流感病毒H9 亚型特异性阳性血清，猪流感病毒H1N1亚型HA和NA基因阳性质粒，猪流感病毒H3N2 亚型HA 和NA基因阳性质粒，均由哈尔滨兽医研究所惠赠；病毒基因组DNA/RNA 快速提取试剂盒，购自北京博迈德生物技术有限公司；DL-2000 DNA Marker，宝生物工程（大连）有限公司产品；猪流感H1、H3、N1 和N2 的分型鉴定引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1%鸡红细胞悬液，由哈药集团生物疫苗有限公司质量管理部参照现行《中国兽药典》制备保存；PBS 溶液，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制保存；SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；4～6周龄健康易感的阴性仔猪10头，购自哈尔滨市郊某猪场；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 病料的处理

取出采集到的鼻拭子样品，充分振荡后分别取出鼻拭子中的液体置于无菌离心管中，标明序号，随后将样品经8 000 r·min-1离心10 min，取上清液保存于-70 ℃冰箱中，备用。

2.2 病毒的分离

将处理好的上清液无菌接种于10～11 日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每个样品接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 mL，接种后将鸡胚的接种孔封蜡并置于35 ℃、湿度为60%～65%的孵化箱中培养，每隔12 h检胚1次，24 h内死亡的鸡胚直接弃去，24 h后死亡的鸡胚逐一收获，培养72 h 取出全部鸡胚置于2～8 ℃冷却12 h以上，分别无菌收获鸡胚尿囊液并留样进行红细胞凝集试验。检出阳性样品，置于-70 ℃冰柜保存备用，盲传3 代仍为阴性的样品视为阴性，直接弃去（凝集价＜1∶16 判为阴性，凝集价≥1∶16判为阳性）。

2.3 半数鸡胚感染量（EID50）的测定

用PBS 液将分离获得的病毒液作10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74 个稀释度，分别经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚鸡胚接种0.1 mL，置35 ℃、湿度为60%～65%的孵化箱中孵育观察72 h，逐个收获鸡胚的尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶16者判为感染，使用Reed-Muench法计算EID50。

2.4 病毒的鉴定

2.4.1 血清学鉴定

取检测为阳性的样品按照现行《中国兽药典》中方法配制4 HAU 抗原，分别与猪流感病毒H1、H3、H5、H9亚型特异性阳性血清中和，通过红细胞凝集抑制试验进行血清学鉴定。

2.4.2 分子生物学鉴定

取阳性样品，按剂盒说明书提取RNA。取10 μL RNA 进行反转录，反应体系为20 μL：依次加入 Radom Primer 1 μL，模板 RNA 10 μL，72 ℃5 min后冰浴5 min，再加入5×反转录酶Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、RNA 酶抑制剂 0.5 μL、M-MLV 反转录酶1 μL、dd H2O 1.5 μL，然后置于96 ℃5 min，37 ℃反转录1 h，用于PCR反应。

用猪流感病毒H1、H3、N1、N2 亚型分型鉴定引物进行PCR 鉴定，所扩增片段大小依次为320 bp、750 bp、738 bp 和 498 bp[11]。PCR 扩增体系为 25 μL：依次加入 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌去离子水17.0 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，H1 型 53 ℃、H3 型 53.5 ℃、N1 型 52.5 ℃、N2 型 53 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止循环。将扩增得到的产物于1%琼脂糖凝胶中电泳并与DL-2000 DNA Marker进行比较，得出试验结果。

2.5 病毒的纯化与鉴定

按照2.3 中方法，用PBS 液稀释分离到的病毒液，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 个稀释度接种SPF 鸡胚，每个稀释度接种5 枚鸡胚，每次仅收获阳性样品中最高稀释度的单胚尿囊液用于传代，连续纯化3 代后的病毒液作为F0 代，进行扩繁F1代。纯化后的病毒按照2.4.1、2.4.2 中的方法进行血清学及分子生物学鉴定。

2.6 病毒的电镜鉴定

将纯化后的病毒样品送至哈尔滨兽医研究所电镜室，进行电镜鉴定。

2.7 动物回归试验

从哈尔滨市郊购买4～6周龄健康易感的阴性仔猪10 头，随机选取5 头，分别经气管接种病毒含量≥106.0EID50·0.1 mL-1的纯化后的分离株病毒液4.0 mL，其余5头相同条件下饲养作为对照。攻毒后1～5 d连续测温，并观察记录猪流感特异性临床症状；攻毒后1～3 d，每天分别采集每头猪的鼻拭子并标记好耳号，参照2.2中方法对30份鼻拭子样品进行病毒分离，每份样品接种的鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价≥1∶16，即判为病毒分离阳性。分离阴性的样品，应盲传1代，如仍为阴性，即判为病毒分离阴性；攻毒后5 d，对所有仔猪进行大体剖检，并观察肺部病变。

3 结果与分析

3.1 病毒的分离

按照2.2 中方法操作，其中1 份病料接种的鸡胚盲传2 代时收获的鸡胚尿囊液出现红细胞凝集，效价为1∶128，通过有限稀释法接种10～11 日龄鸡胚检测 EID50为10-5.32EID50·0.1 mL-1，结果见表1。病毒分离的胚体病理变化结果见图1。由图1 可见，接种后鸡胚的胚体出现水肿、出血等病理变化。