新型冠状病毒E蛋白结构与免疫优势表位的信息学预测分析

李明洋，SAIDU Kamara，汪琪，郭艳茹，李青峰，朱珊丽，陈俊，蒋朋飞，张丽芳

温州医科大学 分子病毒与免疫研究所 病原生物与免疫学系，浙江 温州 325035

新型冠状病毒病（corona virus disease 2019，COVID-19）暴发，严重影响了公众的生活秩序和生命安全。目前认为新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）为COVID-19的病原体，与SARS-CoV是姊妹病毒[1]。SARS-CoV-2是目前已知第7种可以感染人的冠状病毒（coronavirus，CoV），其基因组为线性单股正链RNA，可编码刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）、核衣壳蛋白（N）等结构蛋白[2]。其中，E蛋白结构最小，仅由约80个氨基酸残基组成，分布于CoV的包膜表面，可与M蛋白共同诱导CoV的病毒样颗粒形成，在病毒装配、出芽、包膜形成中发挥着重要作用，若CoV E蛋白缺失，则影响病毒的成熟、增殖，导致子代病毒毒力下降[3]。因此，E蛋白也成为CoV疫苗研究的候选靶抗原之一。本研究基于SARS-COV-2 E蛋白的氨基酸序列，运用生物信息学软件预测和分析E蛋白结构及免疫优势表位，为SARS-CoV-2药物筛选和疫苗研制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 SARS-CoV-2 E蛋白氨基酸序列及理化性质 从美国国家生物技术信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank数据库中获取SARS-CoV-2 E蛋白的氨基酸序列（QHD43418.1），并通过EXPASY服务器（https://www.expasy.org/tools）上的ProtParam软件分析预测其理化性质。

1.2 SARS-CoV-2 E蛋白二级结构预测 分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR等方法，分析预测SARS-CoV-2 E蛋白的二级结构。

1.3 SARS-CoV-2 E蛋白跨膜区域预测 分别应用EXPASY服务器上预测跨膜结构的TMHMM、Phobius软件，同时预测SARS-CoV-2 E蛋白跨膜区域。

1.4 SARS-CoV-2 E蛋白B细胞表位综合分析 应用EXPASY服务器上的ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）软件对SARS-CoV-2 E蛋白的Hopp & Woods亲水性系数、Emini表面可及参数、Jameson-Wolf抗原性、Zimmerman极性参数、柔韧性参数和线性表位预测。结合各预测参数并用吴玉章等[4]建立的抗原性指数（antigenicity index，AI）综合分析其B细胞优势表位。

1.5 SARS-CoV-2 E蛋白CTL表位综合分析 应用Net CTL（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、SYFPEITHI、 （http://www.syfp-eithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）、IEDB（http://tools.immuneepitope.org/main/）软件针对HLA-A*02:01、HLA-A*24:02（human leukocyte antigen，HLA，是由HLA基因复合体所编码的产物，存在于所有有核细胞的膜上，是组织排斥反应的主要抗原）及H2-Kd（histocompatibility-2，H2，H-2I类相当于人类HLA的A基因，与移植物排斥反应同样相关）类分子预测E蛋白的CTL限制性表位。结合3个预测软件对CTL表位结果做进一步分析。

1.6 SARS-CoV-2 E蛋白免疫优势表位和同源性分析 综合上述预测的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，选出同时含有多个T或B细胞表位的肽段作为免疫优势表位。应用Vector NTI对已知感染人类的CoV属E蛋白序列及其免疫优势表位进行同源性比对。

1.7 SARS-CoV-2 E蛋白三级结构和功能结构域分析 运用蛋白质分析系统EXPASY网站上Swiss Model工具在线分析SARS-CoV-2 E蛋白三级结构并建模，并对该蛋白功能结构进行分析。

2 结果

2.1 SARS-CoV-2 E蛋白的氨基酸序列和理化性质SARS-CoV-2 E蛋白由75个氨基酸组成，其氨基酸序列为：MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTA LRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV。ProtParam分析显示该蛋白质相对分子质量约为8.37 kDa，理论等电点（pI）为8.57，可推测分子式为C390H625N91O103S4，不稳定性指数（instability index，II，II＞40 为不稳定蛋白质）为38.68，结果表明该蛋白性质稳定。亲水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）为1.128，通常GRAVY分布在-2～2，正值越大表示疏水性越强，负值越大表示亲水性越强，而两性氨基酸多处于-0.5～0.5；该蛋白质包含较高占比的疏水氨基酸，包括18.7%的亮氨酸（Leu）和17.3%的缬氨酸（Val），综合预测结果表明该蛋白质为疏水性蛋白。

2.2 SARS-CoV-2 E蛋白二级结构分析 应用EXPASY服务器上的GOR、SOMPA预测SARS-CoV-2 E蛋白的二级结构。GOR显示其二级结构由33.33% α螺旋（Alpha helix，Hh）、13.33% β片层（Extended strand，Ee）、53.33%无规卷曲（Random coil，Cc）构成；SOPMA显示其二级结构由44% α螺旋、26.67%β片层、20%无规卷曲、9.33% β转角（Beta turn，Tt）构成。综合预测E蛋白主要由α螺旋为主，共同序列出现在15-39，少见β转角。无规卷曲序列为：52-54，63-66，69-71，见图1。

2.3 SARS-CoV-2 E蛋白跨膜区域的预测 应用EXPASY服务器上预测跨膜结构的TMHMM、Phobius预测SARS-CoV-2 E蛋白，结果显示SARS-CoV-2 E蛋白为跨膜蛋白。TMHMM软件预测氨基酸序列1-11为膜外区域，12-34为跨膜区域，35-75为膜内区域，见图2A；Phobius软件预测氨基酸序列1-11为膜内区域，12-37为跨膜区域，38-75为膜外区域，见图2B。综合跨膜预测软件，预测E蛋白跨膜区域为12-34，且为α螺旋，其序列为LIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAIL，N端位于膜内，C端位于膜外，见图2C。

图1 SARS CoV-2 E蛋白二级结构预测

2.4 SARS-CoV-2 E蛋白B细胞表位的预测分析 应用EXPASY服务器上的ProtScale软件对Hopp &Woods亲水性系数、Emini表面可及参数、Jameson-Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数、柔韧性参数和线性表位预测。提示其B细胞表位区域最可能为SEETGT（6-11），平均AI为0.018；KNLNSSRV（63-70），平均AI为0.036，见图3和表1。

图3 SARS-CoV-2 E蛋白不同参数预测结果

表1 应用不同方法预测SARS-CoV-2 E蛋白表位的肽段位置

2.5 SARS-CoV-2 E蛋白限制性CTL表位预测结果NetCTL 1.2 Server预测数值中包括HLA-I分子的亲和力分值（affinity，aff）、亲和力分值重置值（affinity rescale，aff-rescale）、羧基端酶切效率（C-terminal cleavage，cle）、抗原处理相关蛋白转运效率（transporter-associated antigen processing，tap）和综合分数（combined score，COMB）。根据COMB值越大，特异性越高的特性，选择阈值为COMB＞1.0且aff＞0.5的九肽作为候选表位。HLA-A2限制性CTL表位5个，HLA-A24限制性CTL表位1个，见表2。其中人源HLA-A24限制性CTL表位与鼠源H2-Kd限制性CTL表位序列一致，对Net CTL的初步预测结果再用SYFPEITHI、IEDB做进一步的分析。筛选出的HLA-A2和HLA-A24限制性CTL表位均具有较高的亲和力（SYFPEITHI分值＞20）；IEDB采用人工神经网络进行预测，IC50＜50 nmol/L被认为是高亲和力，且数值越低亲和力越高[5]。因HLA-A24型/H2-Kd型限制性CTL表位的IEDB预测结果为低亲和肽段，仅能参考SYFPEITHI分数，故放在最后。选择SYFPEITHI/IEDB值分数较高的限制性表位肽用于下一步研究。

表2 SYFPEITHI、IEDB软件预测SARS-CoV-2 E蛋白CTL天然表位得分表

2.6 SARS-CoV-2 E蛋白的免疫优势表位和同源性分析 根据上述预测结果最终选择具有多个CTL表位的氨基酸区域P1（16-34aa）和同时具有B细胞表位和CTL表位的氨基酸区域P2（50-70aa）作为免疫优势表位，见图4A。通过Vector NTI软件对α、β、γ和δ属冠状病毒E蛋白与SARS-CoV-2 E蛋白序列进行同源性比对，SARS-CoV-2 P1免疫优势表位与Bat-SARS-like-CoV和SARS-CoV序列完全一致（100%）；P2免疫优势表位与Bat-SARS-like-CoV的序列仍然完全一致（100%），与SARS-CoV序列也表现出高相似度（86%）；而与其他种属冠状蛋白的相似性较低（10%～38%），见图4B。系统进化树的结果显示，SARS-CoV-2、SARS-CoV和Bat-SARS-like-CoV位于同一分支，表明其具有更接近的同源关系，而其他CoV如MERS与SARS-CoV-2虽具有平行关系，但分支相隔较远，物种进化分歧时间更长，亲缘关系更差，见图4C。

2.7 SARS-CoV-2 E蛋白三维结构及功能结构域 运用蛋白质分析系统网站Swiss Model在线分析E蛋白三级结构和功能区域，免疫优势表位P1和P2标记三维结构和功能区域图中，见图5A。红色为P1区段（16-34）SVLLFLAFVVFLLVTLAIL；蓝色为P2区段（50-70）SLVKPSFYVYSRVKNLNSSRV。此外，经NCBI中（conserved domain database，CCD）预测该蛋白中N端（12-34）为跨膜结构域（transmembranedomains，TMD），介导物质运输及信号转导等功能；C端（72-75）为PDZ结合序列（PDZ-bing motif，PBM），与病毒稳定性有关，见图5B。

图4 SARS CoV-2 E蛋白的免疫优势表位和同源性分析

图5 SARS-CoV-2 E蛋白三维结构及功能区域

3 讨论

E蛋白对CoV的感染与致病具有重要意义，作为其孔蛋白（viroporin），可在宿主细胞膜上形成选择性离子通道，介导特殊离子（如Na+、K+、Ca2+、Cl-、H+）运输，从而对病毒的感染复制和增殖等功能产生影响；这不仅有助于阐明SARS-CoV-2高致病性的机制，同时离子通道还可作为一个药物作用的潜在靶点，是抗病毒药物设计的靶点之一[3]。本研究通过信息学分析发现SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1株）与SARS-CoV（BJ01株）两个原型株E蛋白仅有4个氨基酸残基的差别，相似性为94.74%。因此，基于SARS-CoV E蛋白的药物研发可能适用于SARS-CoV-2。

SARS-CoV E蛋白是由76 个氨基酸组成的II型膜蛋白，其功能结构域主要分布于氨基酸的N端和C端。其N端12-34aa区段为疏水性跨膜结构域TMD，该区段主要由亮氨酸和缬氨酸组成，可提供强大的疏水特性，以保证蛋白质结构的稳定性；同时E蛋白同源寡聚化可形成离子通道，其氨基酸序列的Asn 15和Val 25是决定该离子通道活性的关键氨基酸残基，当离子通道转运Ca2+时，可触发并激活炎症小体，进一步诱发炎性肺损伤[6-7]。而E蛋白的C末端包含一个以β-coil-β为基元的保守脯氨酸残基，该基序可能起高尔基体复合物靶向信号的作用，有助于E蛋白的定位并影响病毒的增殖周期[8]；C端的最后四个氨基酸残基（DLLV）为PBM，影响着病毒稳定性和毒力[9-10]。本研究结果显示，SARS-CoV-2和SARS-CoV E蛋白空间结构几乎一致，且TMD和PBM区域序列完全一致（100%）。表明SARS-CoV-2 E蛋白与SARS-CoV具有同样的功能。

研究表明，缺失E蛋白可抑制MERS-CoV病毒颗粒的成熟和转运能力，降低SARS-CoV病毒颗粒的滴度，而以缺失E蛋白和突变羧基端制造的减毒活疫苗，在动物实验中已初步取得疗效。SARS-CoV-ΔE（缺失E蛋白）感染的小鼠肺部，与其相关的大量促炎细胞因子的表达水平降低，而在mRNA和蛋白质水平上，抗炎细胞因子的水平均升高[11]，表明减毒病毒可以导致肺部炎症的减轻以及更强的抗病毒T细胞反应，保护小鼠免受致命病毒的攻击。然而，也有研究发现E蛋白缺失，SARS-CoV辅助蛋白3a和8a表现出相对补偿功能，存在毒力恢复的可能[3]。因此，减毒活疫苗仍然存在不足，提示疫苗研究需要从新的角度考虑。免疫优势表位研究一直是疫苗的前沿研究。由多个B细胞表位或CTL表位组成的免疫优势表位，既可以通过产生的特异性细胞免疫，达到清除病毒的目的，又可以通过产生的特异性抗体，预防病毒感染和复发。本研究通过生物信息学分析预获得2个SARS-CoV-2 E蛋白的免疫优势表位，位于其N端16-34aa和C端50-70aa区段，与α、β、γ和δ属冠状病毒序列比对，发现具有较高的同源性，表明免疫优势表位在一定程度上可同时识别其他CoV感染的细胞，如SARS-CoV。本研究可为基于SARS-CoV-2 E蛋白的发病机制及特异性预治疗疫苗研究提供理论基础。