‘黔藿1 号’在不同种植区的质量稳定性评价研究

雷荣，汪永平，晏凯，刘红昌，3※

（1.贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州贵基生物医药有限公司，贵州 从江 557400；3.贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳 550025）

淫羊藿始载于《神农本草经》，作为药材已有2 000多年的历史，是中国最为悠久的中药材之一[1]，历代本草及苗医药文献均有记载[2]，2020 版《中国药典》记载其基源植物为箭叶淫羊藿[Epimedium sagittatum(Sieb.etZucc.) Maxim.]、淫羊藿（E.breviconu Maxim.）、柔毛淫羊藿（E.pubescens Maxim.）和朝鲜淫羊藿（E.koreanum Nakai.）[3]。淫羊藿以干燥叶入药，性温、味辛、甘，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，常用于治疗肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛及麻木拘挛等病症[4]，并且对于增强心脏功能和抗肿瘤方面也具有一定疗效[5,6]。

淫羊藿为多基源药材，在我国淫羊藿种质资源有45 种[7]，属于品种多、主产区种类复杂、性状难以鉴别的药材[8,9]。不同基源淫羊藿药材化学组成和主要黄酮类成分含量相差较大，现有文献报道多针对某一种淫羊藿不同部位指纹图谱或主要黄酮类成分进行分析[10]，而同一种淫羊藿药材在不同种植区质量变化鲜有报道。本试验以箭叶淫羊藿优良品种‘黔藿1 号’为材料，研究其在不同种植区的质量变化，为其适宜种植区的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为贵州贵基生物医药有限公司自育箭叶淫羊藿优良品种‘黔藿1 号’，经贵州大学植物鉴定中心鉴定为小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（Epimedium）植物箭叶淫羊藿[Epimedium sagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.]，于2017 年种植于贵州省遵义市新蒲新区喇叭镇（S1）、湖南省邵阳市新宁县万塘乡（S2）、安徽省宿州市埇桥区夹沟镇（S3）、安徽省合肥市瑶海区（S4）和河南省南阳市高新区（S5），见表1。

表1 ‘黔藿1 号’不同种植区环境参数Table 1 Environmental parameters of different planting areas of‘Qianhuo No.1’

主要仪器有高效液相色谱仪（Agilent 1260 infinity）、紫外可见分光光度计（T6 新世纪）、电子天平（AR224CN）、箱式电阻炉（SX-5-12）、超声波清洗机（SB-5200DT）和数显恒温水浴锅（HH-6）等。

主要试剂有朝藿定A、朝藿定B 对照品（批号：110623-72-8、110623-73-9，质量分数＞98%，大连美仑生物技术有限公司）；朝藿定C 对照品（批号：111780-201804，质量分数92.6%，中国食品药品检定研究院）、淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516，质量分数94.2%，中国食品药品检定研究院）；色谱级甲醇、乙腈（质量分数≥99.9%）；AR 级甲醇、AR 级乙醇。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 样品于2019 年11 月上旬采收，洗净，晾干，于105 ℃下杀青15 min 后置于55 ℃烘箱内烘至恒重，粉碎，过3 号筛，置于干燥器中保存。

1.2.2 总灰分测定 参照2015 版《中国药典》四部（通则2302）进行测定。

1.2.3 浸出物测定 参照2015 版《中国药典》四部醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的冷浸法测定。

1.2.4 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量测定 HPLC 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱250 mm 4.6 mm 5m；流动相：乙腈-水（30：70）；检测波长：270 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5L。

供试品溶液制备：参照2015 版《中国药典》四部，称取0.200 0 g 样品置于具塞三角瓶中，加入20 mL 50%乙醇，称定重量，超声处理1 h，再称定重量，用50%的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

对照品溶液制备：分别称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷0.02 g、0.005 g、0.05 g 和0.005 g，加甲醇溶解，定容至10 mL 即可。朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷使用前稀释10 倍。

1.2.5 总黄酮含量测定 供试品溶液制备：取1.2.4 项下的供试品溶液稀释100 倍即可。

对照品溶液制备：精密称定淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成含淫羊藿苷20g/mL 的溶液，即得。

1.3 方法学考察

1.3.1 线性关系考察 以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷峰面积为纵坐标（y），对照品溶液进样量（L）为横坐标（x），考察线性关系。回归方程、线性范围及相关系数为朝藿定A: y=252.51x+18.273，0.02～3.2g，R=0.9999；朝藿定B: y=132.92x-4.0069，0.005～0.8g，R=0.9997；朝藿定C: y=567.87x-1.935，0.1～5.5g，R=1；淫 羊 藿 苷: y=356.46x-6.0903，0.005～0.45g，R=1；结果表明朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷分别在上述范围内线性关系良好。以总黄酮吸光度为纵坐标（y），淫羊藿苷浓度为横坐标（x），考察线性关系。回归方程及相关系数为：y=0.0058x+0.0009, R=0.9997，结果表明总黄酮在0～20g/mL 范围内线性关系良好，见图1。

图1 朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及总黄酮标准曲线Fig.1 Standard curve of epimedin A,B,C,icariin and total flavonoids

图2 精密度试验色谱图Fig.2 Chromatogram of precision test

1.2.4 项条件连续进样6 次，记录峰面积。朝藿定A平均峰面积为129.97，RSD 0.41%；朝藿定B 平均峰面积为145.62，RSD 0.84%；朝藿定C平均峰面积为4 853.65，RSD0.64%；淫羊藿苷平均峰面积为2 420.9，RSD0.17%。表明仪器精密性良好，见图2。

1.3.5 加样回收试验 取5 份已知朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量的供试品溶液1 mL，分别加入0.1 mL 0.2 mg/mL 的朝藿定A 对照品溶液、0.4 mL 0.05 mg/mL 的朝藿定B 对照品溶液、0.5 mL 0.5 mg/mL 的朝藿定C 对照品溶液、1 mL 0.05 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液，分别进样并记录峰面积，计算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷平均回收率分别为100.22%、100.34%、100.09%和100.57%，RSD分别为0.45%、0.39%、0.08%和1.09%，表明该试验的加样回收率良好，见表2。

表2 加样回收测定结果Table 2 Determination results of sample recovery

续表2

2 结果与分析

2.1 不同种植区‘黔藿1号’总灰分、浸出物和总黄酮含量比较

不同种植区‘黔藿1 号’药材中总灰分质量分数为6.35～8.99%，CV 为14.80，表明总灰分含量差异较大，以S2 和S3 中总灰分的含量较低，分别是6.37%和6.35%，S5 总灰分含量最高（8.99%），S5 与S1、S2、S3、S4 存在显著差异，S4 与S2、S3 存在显著差异，与S1 无显著差异，S2 与S3 之间无显著差异。不同种植区‘黔藿1 号’药材浸出物CV 为7.19%，其含量存在差异，以S5 中浸出物的含量最低（34.00%），S2 与S3含量最高，均为38.67%，S1、S2、S3 和S4 4 个种植区的含量无显著差异。不同种植区‘黔藿1 号’药材中总黄酮质量分数为9.07～12.48%，CV为11.68%，其含量存在差异，以S5 中总黄酮含量最低，S1 中最高，S1、S2、S3 和S4 4 个种植区之间无差异显著，与S5 存在显著差异，见表3。‘黔藿1 号’药材随着种植区海拔、降雨量和无霜期的变化，其灰分、浸出物和总黄酮含量均为未表现出规律性变化，表明受种植区域小气候及土壤等因子的综合影响较大。

表3 不同种植区‘黔藿1 号’总灰分、浸出物和总黄酮含量比较Table 3 Comparison of the contents of total ash,extract and total flavonoids of‘Qianhuo No.1’in different ecological planting areas （%）

2.2 不同种植区‘黔藿1号’中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分析

‘黔藿1 号’在不同种植区朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷含量存在差异，CV 分别为24.64%、12.50%、10.18%和12.83%。朝藿定A 和朝藿定B质量分数分别为0.07%～0.12%和0.07%～0.09%，S2、S4 中朝藿定A、朝藿定B 含量最低均为0.07%，S3 中朝藿定A和朝藿定B含量为最高，分别为0.12%和0.09%。S4 中朝藿定C 含量最低（5.87%），S3 中含量最高（7.76%），S4 与S1、S3、S5 之间存在显著差异，与S2 之间无显著差异。S2 和S4 两个种植区淫羊藿苷含量最低，均为0.42%，在S1 中淫羊藿苷含量最高（0.55%），与S3 无显著差异，但显著高于其它种植区，见表4。‘黔藿1 号’药材朝藿定C 含量随着种植区海拔的升高而增加；朝藿定A 和朝藿定B 含量随着降雨量的增加有所下降。淫羊藿苷含量随着种植区海拔、降雨量和无霜期的变化，均为未表现出规律性变化。综上分析，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量受种植区域环境因素影响较大。

表4 不同种植区‘黔藿1 号’四种成分含量分析Table 4 Content analysis of four components in Qianhuo No.1 from different ecological planting areas （%）

3 讨论

本研究测定箭叶淫羊藿优良品种‘黔藿1 号’的相关质量指标含量，研究结果表明，不同种植区‘黔藿1 号’药材中总灰分、浸出物、总黄酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量变异系数（CV）分别为14.80%、7.19%、11.68%、24.64%、12.50%、10.18%和12.83%，其中浸出物含量变异最小，朝藿定A 含量变异较大，这与孙梦杰等[11]的研究结果一致。2020 年版《中国药典》规定淫羊藿灰分不得高于8.0%、浸出物含量不得低于15.0%、总黄酮含量不得低于5.0%及总黄酮醇苷不得低于1.50%，而所有样品中浸出物和总黄酮的含量远高于2020 年版《中国药典》规定，河南南阳高新区种植区‘黔藿1 号’药材总灰分含量较高，超过2020 版《中国药典》规定，其余4 个种植区均符合2020 版《中国药典》规定。淫羊藿苷含量是淫羊藿药材质量是否达标的主要衡量指标[12]，所有样品均达到2020版《中国药典》规定，但贵州遵义新蒲新区喇叭镇和安徽省宿州市埇桥区夹沟镇2 个种植区质量较佳。本研究发现‘黔藿1 号’药材中朝藿定C 含量随着种植区海拔的升高而增加；朝藿定A 和朝藿定B 含量随着降雨量的增加有所下降，这也印证了秦伟瀚等[13]的观点，淫羊藿药材成分含量变化，不仅与海拔有关，还与当地的气候、土壤及采收时间等诸多因素相关。本研究测定了‘黔藿1 号’在不同种植区的质量变化，可为其适宜种植区筛选、规范化种植提供参考。