基于GC-MS的福建柏萜类挥发物及其器官差异分析

周成城, 黄 霞, 谢德金, 杨德明, 荣俊冬, 何天友, 郑郁善,

(1.福建农林大学园林学院；2.福建农林大学林学院,福建 福州 350002)

福建柏[Fokieniahodginsii(Dunn) Henry et Thomas]为柏科福建柏属，为我国特有种属，分布在福建、广东、云南、广西等南部省份[1].其树干通直、树型优美、四季常青、适应性强、抗性较好、材性稳定、结构细腻，是我国优良的材用—景观两用型树种之一[2].福建柏精油中含有大量萜类化合物，其中主要成分是萜类挥发物[3-4].但对福建柏各组织部位中的挥发性萜类化合物的成分组成尚不清楚[4-6].本研究对福建柏鳞叶、树皮和根中萜类挥发物的差异性进行分析，旨在鉴别福建柏不同部位萜类挥发物的种类和含量，为从分子层面上探究福建柏萜类挥发物的合成、转运和调控机制提供基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为35年生生长良好、无病虫害的福建柏鳞叶、树皮(包括周皮和韧皮部)和根，于2019年8月采集于福建省福州市永泰县大湖国有林场的福建柏天然林，用无菌水把材料清洗干净并用无菌滤纸擦干，再用锡箔纸包裹后放进干冰中，带回实验室，置于-80 ℃冰箱保存备用.3个部位材料取自同一区域内年龄相近、长势相同的3株福建柏，各设置6个生物学重复.

1.2 方法

1.2.1 物质提取和SPME进样 从-80 ℃冰箱中取出样品，采用液氮研磨，保证样本不变质.样本保存于液氮中，并快速称取10 g，分别加入2 mL NaCl饱和溶液和10 μL内标溶液(2,6-二甲基-4-庚酮)，置于15 mL顶空瓶中.在老化温度为250 ℃下处理5 min，在加热温度60 ℃下处理10 min.将SPME萃取头插入样品瓶顶空部分，收集20 min后将萃取头收起，并插入气相色谱进样口.

1.2.2 GC-MS检测 色谱条件：采用DB-5MS的色谱柱，柱流速为1 min-1，不分流，前进样口温度为250 ℃.升温程序：40 ℃保持1 min，以5 ℃·min-1的速度升至280 ℃并保持 3 min.采集模式为全扫描，离子源温度为230 ℃，以电子轰击离子化，电离电压值为70 eV，MS四级杆的温度为150 ℃.

1.2.3 数据统计与分析 将质谱与数据库系统(NIST 14)和线性保留指数进行比较，以鉴定萜类挥发物.采用Microsoft Excel 2010统计萜类挥发物浓度平均值和标准差.利用R中3个R包(pheatmap, venndiagram和scatterplot)制作萜类挥发物含量的热图、韦恩图和PCA主成分分析图.利用在线软件MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)进行PLS-DA分析.

2 结果与分析

2.1 福建柏萜类挥发物的种类鉴定

以福建柏叶片、树皮以及根为材料进行了GC-MS分析，得到福建柏萜类挥发物的总离子流图(图1)，分离出142个色谱峰，共检测出45种萜类挥发物.按照碳架结构分类，将45种萜类挥发物分成五大类，包括10种单萜烯、10种单萜类衍生物、17种倍半萜、6种倍半萜类衍生物、2种二萜类衍生物.检测结果中的萜类挥发物信息如表1所示.

表1 福建柏萜类挥发物分类1)Table 1 Classification of terpenoid volatiles in F.hodginsii

图1 福建柏萜类挥发物的总离子流图Fig.1 Ion chromatogram of terpenoid volatiles in F.hodginsii

对3个器官的萜类挥发物总量进行比较，发现树皮中挥发物含量最高(相对含量为55.01%)，叶中次之(相对含量为34.74%)，根中最少(相对含量为10.25%).表明萜类挥发物总量呈现明显的器官差异.对每一类萜类挥发物的总量作进一步分析，发现单萜烯和倍半萜是含量较高的两大类物质，分别占萜类挥发物总量的42.93%和53.87%.其中单萜烯在叶中含量最高，倍半萜在树皮中含量最高.

对每一种萜类挥发物的含量进行分析,发现α-蒎烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、长叶烯、顺式菖蒲烯和柠檬烯是福建柏萜类挥发物中的主要成分.由图2可以看出：这6种物质在3个器官中的含量均在60%以上，但含量差异较大.在叶中α-蒎烯含量最高，达到51.52%；在根中长叶烯含量最高，为44.96%；在树皮中主要成分含量的差异较小，γ-杜松烯含量最高，为26.14%.与其他几个主要成分相比，柠檬烯在根和树皮中的含量也相对较低，顺式菖蒲烯则在树皮中没有被检测到.

图2 福建柏器官中萜类挥发物主要物质相对含量比例 图3 福建柏3个器官萜类挥发物数量示意图 Fig.2 Main components and proportions of terpenoid volatiles in F.hodginsii Fig.3 Venn diagram of terpenoid volatiles detected in 3 organs of F.hodginsii

对福建柏45种萜类挥发物进行韦恩图分析(图3)，其中27种物质在3个器官中均被检测出来；4种物质只在树皮中被检测到，分别是双环烯庚酮、反式卡拉曼烯、丹参酮和榄香醇，但含量都较低.α-长叶蒎烯在根中被检测到，叶中没有检测到；叶中含有萜类挥发物组分.乙烯基环已酮、3-松樟酮、香附烯酮和紫杉醇在根和树皮中均被检测到；左旋乙酸冰片酯和顺式菖蒲烯均在叶和根中被检测到；p-薄荷三烯、环己二烯苯甲醛、匹诺酮、马鞭草烯酮、双环水芹烯、β-波旁烯和桉油烯醇在叶和树皮中均被检测到.因此，在福建柏3个器官中，树皮的萜类挥发物种类是最丰富的.

2.2 福建柏萜类挥发物的器官差异分析

45种物质含量的热图分析如图4所示.按照热图左侧聚类关系，萜类挥发物可以分为4组，分别以蓝色、黄色、红色、绿色4种颜色表示，并分别命名为分组Ⅰ、分组Ⅱ、分组Ⅲ和分组Ⅴ(图4).

G1～G6：根样本6个重复.Y1～Y6：叶样本6个重复.P1～P6：树皮样本6个重复.图4 福建柏萜类挥发物含量的热图分析Fig.4 Heat map analysis of terpenoid volatiles in F.hodginsii

GroupⅠ共有11种萜类挥发物，包括3-蒈烯(D4)、γ-松油烯(D5)、匹诺酮(D12)等5种单萜烯及其衍生物，以及长叶烯(D31)、δ-杜松烯(D35)、石竹烯氧化物(D38)等5种倍半萜及其衍生物.这组物质在树皮单个器官中的含量差异最显著，在叶和根中的含量相对较低，甚至不含有.GroupⅡ共有24种萜类挥发物，该组物质在根中的含量相对较低，差异明显.该组还能分为两个亚组：以α-蒎烯(D1)、莰烯(D2)、柠檬烯(D7)、β-蒎烯(D8)等12种物质组成一个亚组，该亚组的物质主要以单萜烯及其衍生物为主，这些物质在叶和茎的含量差异不大；以马鞭草烯酮(D17)、γ-杜松烯(D21)、γ-丁二烯(D25)等12种物质组成另一个亚组，该亚组的物质主要以倍半萜及其衍生物为主，这些物质在“茎—叶—根”中的含量呈“高—中—低”阶梯式变化.GroupⅢ只有左旋乙酸冰片酯(D19)和顺式菖蒲烯(D32)两种物质，在树皮中没有检测到，在叶和根中的含量较高.GroupⅣ共有8种萜类挥发物，主要有长叶烯(D31)、β-红没药烯(D36)、香附烯酮(D43)、α-长叶蒎烯(D45)等，这些物质在叶中的含量较低，在根和茎中的含量较高.

2.3 福建柏特征萜类挥发物的鉴定

基于热图中聚类分析的结果，进一步对福建柏萜类挥发物的物质含量进行PCA分析(图5)，以3个器官(各6个重复样品)为类别进行分析，结果表明福建柏不同器官在PCA模型中的3个维度都存在明显分离，且3个器官的重复样本均没有重合.在第一主成分上的贡献度达到59.83%，第二主成分的贡献度为28.18%，第三主成分的贡献度为4.52%.第一和第二主成分的总贡献度已经超过85%，已经能区分出3个器官的差异.而第三主成分主要是用于区分各器官6个重复样本的差异性，结果表明在树皮中6个重复样本的差异较小，而在叶和根中差异较大.说明福建柏萜类挥发物在树皮中的含量波动小，在叶和根中的含量波动大.

G1～G6：根样本6个重复.Y1～Y6：叶样本6个重复.P1～P6：树皮样本6个重复.图5 福建柏萜类挥发性物质的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of terpenoid volatiles in F.hodginsii

对福建柏45种萜类挥发物进行PLS-DA模型分析(图6).在交互检验中，3个主成分的R2和Q2都超过0.8，接近1.0，表明PLS-DA模型没有过拟合.在置换检验中，每100个重复中就有一个统计样本的统计显著性P=0.01，说明PLS-DA模型的数据可靠.

A.置换检验结果的统计直方图；B.主成分交互检验结果.图6 福建柏萜类挥发物PLS-DA模型的检验Fig.6 Validation of terpenoid volatiles in F.hodginsii by PLS-DA model

利用PLS-DA分析结果中变量重要性投影值(VIP分数)可以鉴别福建柏器官之间的差异特征性萜类挥发物.VIP分数大于1.0的物质在鉴别过程中起着重要的作用，有助于解释萜类挥发物在器官间的差异.从图7可知，鉴定出45种萜类挥发物中有15种挥发物的VIP分数大于1.0，在福建柏叶、根、树皮3个器官中的含量都有明显差异.这15种物质分别为β-波旁烯(D26)、p-薄荷三烯(D9)、乙烯基环已酮(D15)、布藜烯(D29)、柠檬烯(D7)、β-蒎烯(D8)、α-水芹烯(D10)、3-松樟酮(D16)、长叶烯(D31)、α-衣兰烯(D34)、α-蒎烯(D1)、桉油烯醇(D39)、α-长叶蒎烯(D45)、双环水芹烯(D22)、β-红没药烯(D36).单萜烯及其衍生物只有5种，二萜衍生物1种，倍半萜及其衍生物有9种，说明倍半萜类物质在福建柏不同器官中的含量差异显著.进一步分析发现，β-波旁烯、p-薄荷三烯的VIP分数排名前二，分别为1.55和1.51，两者在根中均没有被检测到，在叶中含量相对较高.但从总含量分析可知，这两种物质的含量相对较低.乙烯基环已酮和布藜烯的VIP值较大，在叶中含量较低，在根中含量较高，这两种物质总含量也较低.在剩余的7种物质中，柠檬烯、β-蒎烯、长叶烯、α-蒎烯和双环水芹烯这5种物质的VIP分数大于1.0，物质含量占总含量的比重也较高，占45种萜类挥发物总量的40.07%.

图7 PLS-DA分析中VIP分数(VIP>1.0)的物质排序Fig.7 Rating of VIP scores (VIP>1.0) by PLS-DA analysis

3 讨论和小结

植物挥发物一般是次生代谢产物，具有明显的组织特异性[7-8].其中萜类化合物是主要的植物挥发物之一，目前已鉴定出结构的萜类化合物超过25 000种[9].本试验采用GC-MS技术对福建柏鳞叶、树皮和根3个器官的萜类挥发物成分进行测定，结果表明单萜类和倍半萜类化合物是福建柏萜类挥发物中的主要成分，其中α-蒎烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、长叶烯、顺式菖蒲烯和柠檬烯是福建柏萜类挥发物中的主要物质.α-蒎烯的含量最高，这与潘炯光等[4]、卢钰铎等[5]的研究结果一致；其他物质含量较高的结果与前人研究存在一定差异，可能是由于福建柏的树龄、采样部位、采样时间、采样地点等不同[4-6].而研究[4-5]表明福建柏叶片中柠檬烯的含量也较高，与本研究的结果相符合.说明在福建柏叶片中柠檬烯的合成量大且稳定.此外，在华山松、沙地柏、杉木、马尾松、欧洲赤松等裸子植物的叶片中，柠檬烯也是含量较高的萜类化合物[10-13].

从福建柏3个器官的萜类挥发物总量分析可知：福建柏树皮中检测到的萜类挥发物种类最多，总量最大；仅在单个器官中含有双环烯庚酮、反式卡拉曼烯、丹参酮、榄香醇和α-长叶蒎烯，含量都较低.说明在福建柏中大部分萜类挥发物在3个器官中都能够被检测出，但在各器官的含量有明显差异性.PCA分析显示前3个贡献度超过85%，表明3个器官中萜类挥发物的含量存在明显差异，且在树皮中的样品重复差异小，说明树皮中的萜类挥发物含量波动较小.综上可知，福建柏在树皮中的萜类挥发物具有明显的组织特异性，可能是由于本试验选取的植物材料为20年生福建柏，成年树种的树干粗壮且生命活动旺盛，根系发达，木质化程度高，物质合成速率高且稳定.在树皮中检测到较多的萜类挥发物，可能是次生代谢物质合成的.因为本试验树皮样本主要是韧皮部，韧皮部是有机物运输的途径[14]，因而福建柏树皮中萜类代谢物有差异性且含量较高.

利用PLS-DA模型对每种萜类挥发物在器官间的差异作进一步分析，结果表明柠檬烯、β-蒎烯、长叶烯、α-蒎烯和双环水芹烯5种物质在福建柏器官间有明显差异性且含量较高.α-蒎烯对人体有镇痛、杀菌消毒、抗病毒、使人镇静等作用，有益于人体的身心健康[15].在福建柏中α-蒎烯含量最高，其同分异构体β-蒎烯的含量也较高(尤其在树皮中)，这对福建柏的药用价值开发有一定的指导意义.