解磷菌的沙培法筛选及解离煤矸石研究

2021-04-13姜雄李夏夏王应兰张景宁谢承卫

广西大学学报（自然科学版） 2021年1期

关键词：溶性煤矸石芽孢

姜雄，李夏夏，王应兰，张景宁，谢承卫

(贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳 550025)

0 引言

磷是植物生长所必须的营养元素之一，磷元素能够促进植物各种代谢正常及生长发育[1-2]。我国土壤整体表现为缺磷，因为土壤里绝大部分磷都是难溶性磷，不能直接被植物吸收利用[3]，所以提高土壤中有效磷的含量对农林业具有重要的意义。

研究发现，土壤中存在一些能够将土壤中难溶性无机磷分解为可溶性磷的微生物，该类细菌被称为解磷菌，利用解磷菌活化土壤难溶性无机磷因具有高效、环保且与土壤具有亲和性等特点[4]，在相关领域越来越受重视。

解磷菌的筛选方法有沙培法和难溶性无机磷液体培养法2种[5]。液体培养法以磷酸钙为磷源，筛选出高效的解磷细菌。该法筛选得到的解磷菌株，对不同的磷源，其解磷能力和解磷效果具有明显的差异，郭渊等[6]筛选得到一株肠膜明串菌株，将肠膜明串菌株对5 种不同磷源(磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝、植酸钙、卵磷脂)进行解磷研究，研究发现肠膜明串菌株对上述5 种难溶性磷源都具有分解能力，但是对不同磷源的分解能力差异较大，其中对磷酸三钙的分解能力最强，远远强于对其他磷源的分解。沙培法是将目标矿物作为唯一磷源，将初筛得到的菌株直接对目标矿物进行解离，测量解离前后的有效磷的含量从而筛选出高效的解磷细菌。通过沙培法筛选得到的解磷菌株对目标矿物更具有针对性和高效性，并且能够避免采用单纯液体培养方法，丢失部分解磷菌的问题。

煤矸石是一种采煤过程中产生的固体废弃物，占原煤的15 %～20 %，全国的煤矸石堆存量有数十亿吨之多，且目前煤矸石的综合利用率不高[7]。煤矿的大量开采，产生的大量煤矸石长期堆放不仅占用土地面积，而且造成环境污染[8-9]。

煤矸石中含有丰富的营养成分，其中含有SiO2、P2O5、Al2O3、Fe2O3、CaO、MgO、Na2O、K2O 等，另外还有少量的稀有元素，比如 Ni、B、Be 等[10-12]，这些成分能够满足植物生长需要。而煤矸石中磷多以难溶性无机磷的形式存在，不能直接被植物所利用，利用解磷微生物将其转换为可溶性磷，则能将煤矸石作为一种微生物肥料为植物提供所需的磷素，为煤矸石的资源化利用提供一个新的可能[13-15]。

1 实验

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株与对照菌株

实验菌株(GJ-6)从贵州省铜仁地区万山某矿区采样，通过沙培法筛选、纯化、培养得到。对照菌株使用巨大芽孢杆菌。

1.1.2 煤矸石样品

煤矸石样品来自于贵州省某煤矿集团三个不同矿区。其成分如表1所示。

表1 3种煤矸石的化学成分及含量

1.1.3 培养基

难溶性无机磷液体培养基：葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸镁0.3 g，硫酸铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，磷酸钙10 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7.0～7.2。

难溶性无机磷固体培养基：在难溶性无机磷液体培养基里面加入15～20 g琼脂。

LB固体培养基：蛋白胨5 g，氯化钠5 g，牛肉膏1 g，酵母粉2 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4。

1.2 实验方法

1.2.1 解磷菌的筛选，纯化与保存

使用难溶性无机磷培养基进行解磷菌的初筛，将初筛得到的菌株制备成菌悬液，以煤矸石作为唯一磷源，吸取2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌悬液20 mL于装有10 g煤矸石的无菌培养皿中，将菌液与煤矸石混匀，放入35 ℃的恒温培养箱中培养3 d。进行3组对照实验，按照文献[16]测定解离前后中煤矸石中有效磷的含量变化，与巨大芽孢杆菌作对比，将解磷效果较好的菌株4 ℃斜面保藏备用。

1.2.2 解磷菌的鉴定

将纯化保种后的菌株在LB固体培养基上，于35 ℃恒温培养2 d，待长出单菌落后，观察细菌菌落的特征，包括形状、大小、颜色、干湿性、透明度、隆起程度等，并对纯化后的菌株进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析

用16S rRNA(2F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′)通用引物进行PCR扩增，扩增条件如表2所示。

表2 PCR扩增反应体系及反应条件

将PCR扩增得到的产物进行琼脂糖电泳实验，观察凝胶成像结果。PCR扩增产物送往上海立菲特生物技术有限公司测序，对测定结果进行系统发育分析，构建系统发育树。

1.2.4 解磷菌的解离煤矸石能力测定

① 将筛选得到的解磷菌株，与通过液体培养法筛选得到的解磷细菌进行对比，对煤矸石进行解离实验。将供试菌株同时接种于LB固体培养基中，用无菌水洗下制备成2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌悬液，分别吸取20 mL菌悬液于装有煤矸石的无菌培养皿中，搅拌均匀，于35 ℃的恒温培养箱中培养3 d，将解离完成的煤矸石样品烘干，按照文献[16]测量其中的有效磷含量。

② 将筛选得到的解磷菌株，与巨大芽孢杆菌进行对比，对煤矸石进行解离单因素实验和正交实验，获得最佳的解离条件。将GJ-6和巨大芽孢杆菌同时接种于LB固体培养基中，用无菌水洗下制备成2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌悬液，分别吸取60 mL的GZ-125菌悬液和70 mL的巨大芽孢杆菌悬液于装有煤矸石的无菌培养皿中，分别将pH调节至6和7，然后放入35 ℃的恒温培养箱中，分别培养7 d和6 d。将解离完成的煤矸石样品烘干，按照文献[16]方法分别测定其中的有效磷的含量。

2 结果与讨论

2.1 解磷菌的筛选

初筛即挑选出能够在难溶性无机磷培养基上生长，且长势好的菌株进行分离纯化，得到具有一定解磷能力的菌株。将初筛得到的菌株，使用沙培法将煤矸石作为目标矿物进行解离，并以巨大芽孢杆菌做参照，测定解离后样品的有效磷含量，初步筛选出15株具有较好的解离细菌，并将其编号为GJ-1～GJ-15(图1)。由图1可知，15株解磷菌株解磷效果均优于巨大芽孢杆菌，且GJ-6解磷效果最佳。

图1 细菌筛选结果

2.2 GJ-6的菌落及菌体形态

GJ-6在LB固体培养基上的单菌落形态如图2(a)所示，菌落形态不透明，形状边缘规则，表面湿润，有凸起，呈乳白色，有光泽，菌落大小约2 mm。如图2(b)所示，GJ-6经革兰氏染色后，在显微镜下观察为革兰氏阴性(G—)杆菌。

2.3 PCR及琼脂糖电泳实验

将GJ-6号菌进行PCR扩增反应，其扩增后的产物用质量分数为1.2 %的琼脂糖凝胶电泳观察(图3)。如图3所示，左边亮带为2 000 bp DNA分子质量标准，右边的亮带为GJ-6，由图3可知，GJ-6号菌的基因组DNA扩增结果为1 401左右的16S rRNA基因特异性片段，与预期结果相符。

(a) 菌落形态

图3 GJ-6 菌株 16S rRNA PCR 扩增结果

2.4 进化树构建与分析

将GJ-6菌株琼脂糖电泳实验结果进行胶回收，送往测序公司进行测序。对测序结果进行系统发育分析，构建系统发育进化树，如图4所示。由图4可知，GJ-6菌株与节杆菌属在同一分支上，同源性达99 %，结合显微形态确定GJ-6菌株为节杆菌。

图4 GJ-6 基于16S rRNA 序列构建的系统发育进化树

2.5 解磷菌解磷煤矸石的结果

2.5.1 GJ-6菌株解离3种煤矸石结果

GJ-6号菌对3种煤矸石的解离效果都优于商业巨大芽孢杆菌，且处理煤矸石3的效果优于其他2种煤矸石，结果如图5所示。因此以煤矸石3为目标矿物，对GJ-6的解磷能力进行进一步研究。

图5 GJ-6解离3种煤矸石结果

2.5.2 GJ-6与液体培养法筛选细菌解离煤矸石结果

将沙培法筛选得到的解磷细菌GJ-6与实验室部分通过液体摇瓶培养筛选得到的6株解磷细菌进行解离3号煤矸石的对比实验。实验结果显示沙培法筛选的GJ-6菌株对煤矸石的解离效果均优于其他液体摇瓶培养筛选的菌株，结果如图6所示。

图6 GJ-6与液体摇瓶培养筛选菌株解离煤矸石结果

2.5.3 GJ-6菌株解离煤矸石正交结果

将GJ-6和巨大芽孢杆菌2种菌分别对煤矸石3进行解离实验，主要对体系 pH、接菌量、解离时间、煤矸石粒度进行单因素实验。根据单因素结果(表3)发现，菌株对矿物粒度不敏感，因此使用采样、缩分和制样，并粉碎至0.25 mm的煤矸石3作为解离对象对两株菌株分别设计L4(2)3正交实验(表4)。从表3和表4可知，巨大芽孢杆菌的最佳解离条件下，煤矸石的有效磷含量为93.71，是原样空白的13.5倍；GJ-6菌株的最佳解离条件下，煤矸石的有效磷含量为124.24，是原样空白的17.9倍。结果如表4所示。